Abstract
Fundo
Há confusão sobre a definição do termo "estado viabilidade (s)" de microrganismos. "técnicas de coloração vitais" "coloração Viabilidade" ou são usadas para distinguir ao vivo a partir de bactérias mortas. Estas colorações, estabelecido pela primeira vez em bactérias plactônicos, pode ter graves deficiências quando aplicados a biofilmes multiespecíficas. Resultados de técnicas de coloração deve ser comparado com os dados microbiológicos adequados.
Discussão
Muitos termos descrevem "estados de vida" de microrganismos, no entanto, vários deles são enganosas. Autores definem "viável" como "capaz de crescer". Assim, métodos de coloração são substitutos, já que nenhuma coloração pode provar a viabilidade
A confiabilidade de uma "viabilidade" comercial ensaio de coloração (Molecular Probes) é discutida com base na correspondente folha de informações sobre o produto:. (I) princípio de coloração; (Ii) concentrações de bactérias;.
(III) Cálculo de proporções vivas /mortas in vitro
Resultados do kit "viabilidade" são dependentes da concentração das manchas e na sua relação com o número de bactérias no teste. Geralmente este sistema de coloração não é adequado para multiespecíficas biofilmes, assim, declarações incorretas foram publicadas por usuários desta técnica.
Para comparar os resultados da coloração com parâmetros bacterianas técnicas apropriadas devem ser selecionadas. A avaliação de Colony Forming Units é insuficiente, em vez do cálculo da eficiência de plaqueamento é necessário. coloração por fluorescência vital com Fluoresceína diacetato e brometo de etídio parece ser o melhor método comprovado e adequado em pesquisa biofilme.
de mutagenicidade de componentes de coloração os usuários devem estar cientes de que não só o brometo de etídio pode ser prejudicial, mas também uma variedade de outros substâncias de que a toxicidade e mutagenicidade não é relatada
Resumo
-. a nomenclatura relativa a "viabilidade" e "vitalidade" deve ser usado com cuidado.
- o manual do kit comercial "viabilidade" em si aponta que o kit não é adequado para a investigação de múltiplas espécies naturais biofilme, como suportado por um conjunto de literatura
-. os resultados obtidos com diversas manchas são influenciadas pela relação entre as contagens bacterianas e a quantidade de corante utilizado no teste. Correspondentes dados de vida são propensos a mudança artificial Restaurant -. Como parâmetro microbiológico a eficiência de plaqueamento deve ser usado para comparação.
- Brometo de etídio é mutagênico. Os pesquisadores devem estar cientes de que os compostos de coloração alternativos também podem ser ou até mesmo são mutagênicos.
Palavras-chave
estado Dental placa biofilme Microorganismos Viabilidade de fluorescência Vital viabilidade bacteriana kit Mutagenicidade fundo
A definição do chamado "estado de viabilidade ( s) "de microrganismos tem sido uma questão de confusão e discussão durante décadas (para um vislumbre da pletora de literatura ver [1-5]). Recentemente, dois manuscritos discutido este tema. Hannig et ai. [6] investigaram a influência de um anti-séptico bucal contendo romance microclusters hidroxiapatita na aderência bacteriana usando a BacLight ™ vivo técnica de coloração /morto. Tawakoli et ai. [7] comparou diferentes ao vivo /colorações mortos "para detecção e quantificação de microrganismos aderentes"
no biofilme oral inicial. De acordo com a literatura anterior, esses dois artigos demonstram que tentativas sérias foram feitas nas últimas décadas para definir os diferentes estados entre mortos e viver microorganismos (marinhos e orais), e que "a coloração de viabilidade" ou "técnicas de coloração vitais" foram e ainda são usados como um teste para superar o problema da distinção entre microorganismos vivos e mortos em biofilmes.
nos últimos anos, mais e mais cientistas em pesquisa biofilme dental tornaram-se familiarizado com manchas de vitalidade /viabilidade comercialmente disponíveis, especialmente a BacLight Assay ( BLA; BacLight ™ viver /técnica de coloração mortos). No entanto, este princípio coloração tem graves deficiências quando aplicados a amostras de biofilme multiespecíficas naturais indefinidos. Os resultados desta e de outras técnicas de coloração deve ser comparada com as técnicas microbiológicas clássicas como a avaliação de unidades formadoras de colónias (CFU) e, mais fiáveis, o cálculo da eficiência de plaqueamento bacteriano (PE). Estas comparações com um "padrão ouro" são muito raros, quando kits comerciais são usados em pesquisas biofilme. Além disso, os componentes destas manchas vitais podem ser potencialmente mutagénicas.
Em resumo, o objetivo deste artigo é debater a base, a utilidade e o risco de "viáveis" e "vitais" manchas especialmente em pesquisa biofilme, com especial atenção a biofilmes dentais naturais e coloração por fluorescência vital com Fluoresceína diacetato /brometo de etídio [8]. De um ponto de vista científico, é importante que os dados derivados de tais técnicas de coloração deve refletir o status bacteriana corretamente.
Discussão
Qual é a raiz do problema?
De um ponto de vista holístico do debate abrange diferentes níveis. Em primeiro lugar, a discriminação de microorganismos vivos ou mortos representa um problema crucial em bacteriologia (ambiental). Este problema básico já existe há décadas e ainda não foi resolvido. A este respeito, os termos "vida" e "viabilidade" são muitas vezes utilizados e, muitas vezes misturada - alguns pesquisadores trocar completamente esses termos [9]
Em segundo lugar, "manchas vitais" geralmente só são substitutos, mas são rápidos e simples. dispositivos em estudos examinando, por exemplo, o efeito anti-bacteriano de substâncias. Aqui, o problema é a grande variedade de substâncias de coloração e, portanto, de princípios de coloração, de modo que o "pletora de escolhas adiciona à confusão"
[10]. Da mesma forma
Pamp et ai. [11] Estado: "manchas Mais recentemente desenvolvidas, tais como as manchas SYTO .... pode eficientemente corar as células em praticamente qualquer cor do arco-íris "
Isso pode soar bem-humorado -., mas apenas reflete o problema. Como já mencionado, Tawakoli et al. [7] utilizadas combinações de vários corantes (por exemplo, a FDA, cFDA, TCFDA, EB, bem como SYTO 9 /PI, Sytox vermelho, além de calceína AM). Davey [10] também se refere a FDA, PI e SYTO 9, mas por outro lado a substâncias como SYTO I verde, DiBac4, piroxina Y, rodamina 123 e laranja de tiazole. Não é à toa que este autor [10] refere-se a outros quatro comentários apenas para informar sobre o "modus operandi"
dos diferentes manchas fluorescentes e o "enorme diversidade de possibilidades em termos de seleção de manchas, concentração, tempo de coloração, etc ".
ao analisar ainda mais, o problema torna-se ainda mais complexa. Alguns autores criticam o uso limitado de iodeto de propídio (PI) como um viabilidade celular (sic!)
Indicador [12, 13], enquanto outros monitorados marcante diferenças entre SYTO 9 e SYTO 12 sobre a influência da porinas na cinética do consumo de estes corantes [14]. Isto significa que, quando substâncias antibacterianas que perturbam a integridade da membrana celular é avaliada a utilização dessas técnicas de coloração vital pode ser enganadora. Um aspecto inerente a esse problema, ou seja, a adequação dos métodos de coloração, é a dependência sobre as concentrações dos manchas dos resultados (ver mais adiante).
Terceiro lugar, os usuários são em sua maior parte, infelizmente, não sabem que tais testes "sedutoras" só foram validados por um número muito limitado de espécies bacterianas [13, 15]. A partir de 15 000 "hits" (250 comentários) gerados no PubMed, pedindo para "citometria de fluxo & amp; bactérias ", apenas três foram deixados após a filtração do banco de dados quando se usa" biofilme "como um termo de rastreamento adicional. Nenhum desses três artigos contribui para o debate.
É crucial que "manchas vitais" e, muito mais importante, suas combinações são directamente comparados com os dados bacteriológicos convencionais. Tal como discutido em detalhe mais tarde este não pode ser a avaliação das UFC, mas de PE. Na odontologia algum trabalho correspondente tiver sido concluído, utilizando simples ou uma série lúcido das espécies in vitro
sem a realização de testes bacteriológicos [6, 16-18], enquanto algumas empresas usaram este método de coloração confiando em si
em sua fiabilidade [ ,,,0],19, 20]. Quando a combinação 9 /PI SYTO foi, de facto, relacionado com correspondentes avaliações microbiológicas o resultado foi inconsistente [21-23]. Em nossa opinião, é impossível encontrar estudos em que os exemplos particulares destas manchas vitais e suas combinações foram devidamente comparadas e relacionadas com os dados microbiológicos relativos multiespecíficas biofilmes naturais como placa dentária.
Finalmente, os corantes podem ser ou são tóxicos ou mutagênicos . No que diz respeito à lista de compostos, tal como anteriormente mencionado e extraído a partir de [7] e [10], deve ser determinado se há um risco de danos ou na utilização destas substâncias.
Viabilidade contra Vitalidade
Netuschil [8] registrou 49 termos para descrever "estados de vida" de microorganismos (por exemplo: micróbios ativos, o crescimento enigmático, contagem viável direta [DVC], dormência progressiva, dormência vegetativa, as células anãs, as células moribundas, nonculturability, nonplateable, sobrevivência estase, viabilidade reprodutiva, viável, mas não cultivável [VBNC], não-viável, mas resuscitable, vital, viviform, etc.) como citado em 34 publicações diferentes correspondentes [1, 2, 4, 24-54] (cf. Tabela 1). Enquanto a tabela apresenta referências de 1962 até 1998, o debate é mais velho e já era relevante na virada do 19
th a 20 th século [55-60]. Um exemplo é "Conte Grande Placa Anomaly" o [61, 62] ver também [63]. Mesmo nessa altura colorações vitais foram debatidas para ser utilizado como um ensaio para ultrapassar os inconvenientes das técnicas de cultura [64-68]. Parece que o passado discussão [69] foi "revitalizada", na virada deste século [41, 70-78]. Digno de nota é que alguns termos (por exemplo, dormente, VBNC) são ainda relevantes quando se refere a bactérias probióticas [79, 80] .table 1 Termos usados para descrever "estados de vida" de microorganismos (a partir de [8])
Aclimatação [ ,,,0],30]
"células em repouso" [17]
micróbios activos [20]
reanimação [3, 4, 15, 24, 28-31]
Alive, "vitalidade" [15]
"desligar células", "desligar estado" [17]
"Anabiotic (dormente) estado "[15]
Somnicells [8, 11, 30]
" Sacos de enzimas "[4, 12]
fome [10, 17, 29]
crescimento Cryptic [24, 26, 27, 29]
- "True fome" [15]
cultiváveis, culturability [4 , 10, 11, 31]
"substrato morte acelerada", "substrato Portal Imobiliário - Nonculturable, nonculturability [22, 24]
estresse acelerado" [6 , 15, 26, 29, 31, 33]
Debilitação [9]
Survival [5, 11, 20, 22, 29]
morto, morte [3, 4, 9, 11, 15, 16, 20, 26], [29]
- "sobrevivência" [3] Portal Imobiliário - "Death fase "[15, 29]
-" Stasis sobrevivência "[25]
" Die-off "[31]
viável [3, 10, 15, 16, 18, 30, 31]
contagem viável direta (DVC), método de DVC [3, 4, 10, 15, 18, 29-31, 34]
- não viável [3, 15, 16, 20]
viabilidade [3, 4, 6, 9, 12, 13, 15, 16], [19, 22, 23, 26, 29]
Dormant, dormência [11, 12, 15, 20, 23, 28-30, 32]
- "viabilidade aparente" [6, 15]
- "dormência Progressive" [1, 30]
- "viabilidade reprodutiva" [23] Portal Imobiliário - "Repouso vegetativo" [15]
Restaurant - "True viabilidade" [6]
células anões, anões inativos, ultramicrobacteria [6, 14, 15, 29, 32]
"viável, mas nonculturable" ( VBNC) [3, 4, 8, 10, 12, 15, 16, 21], [22]
Crescimento prisão [25]
- VBNC hipótese [2-4 , 7]
"Killer fenótipo" [15]
- estado VBNC [3, 4, 10, 22, 24, 29, 31, 33], [34]
lise [20]
- [31] células
moribundos "viável, mas não recuperável" [29]
- "Non -viable mas resuscitable "[16]
'Nonplateable" [24]
- "Unculturable mas viável" [28]
Protistan pastagem [ ,,,0],11]
Vital, vitalidade [15, 16, 26]
"Pseudosenescent" [29]
Viviform [11, 30]
Referências:
1Barcina et al. 1989 [24]
18Kogure et al. 1979 [40]
2Barer et al. 1993 [25]
19Korber et al. De 1996 [41]
3Bogosian et al. De 1996 [26]
20Mason et al. 1986 [1]
4Bogosian et al. 1998 [27]
21McKay 1992 [42]
5Bowden & amp; Hamilton 1998 [28]
22 Morgan et al. 1993 [43]
6Button et al. 1993 [29]
23Nebe-von Caron et al. 1998 [44]
7Colwell 1993 [30]
24 Nilsson et al. 1991 [45]
8 Colwell et al. 1985 [31]
25Nyström de 1995 [46]
9 Dawe & amp; Penrose 1978 [32]
26 Postgate 1977 [47]
10 Duncan et al. De 1994 [33]
27 Postgate & amp; Hunter 1962 [48]
11 Gonzáles et al. 1992 [34]
28 Rose et al. 1990 [49]
12Gribbon & amp; Barer de 1995 [35]
29Roszak & amp; Colwell 1987a [2]
13Höfle 1983 [36]
30 Roszak & amp; Colwell 1987b [50]
14 Hood et al. 1987 [37]
31 Roszak et al. 1984 [51]
15Kaprelyants et al. 1993 [4]
32Stevenson 1978 [52]
16Kell et al. 1991 [38]
33 Whitesides & amp; Oliver de 1997 [53]
17Koch de 1996 [39]
34 Wilson & amp; Lindow 1992 [54]
Infelizmente, vários dos termos encontrados e usados em publicações estão incorretas, enganosas ou mesmo paradoxal, especialmente o termo usado frequentemente "viável, mas não cultivável (VBNC)", que desfoca a linha entre vitalidade e viabilidade. Para minimizar a confusão, tanto quanto possível nos referimos a Kaprelyants et al. [4]: "Vários classificações dos estados fisiológicos de microorganismos foram apresentados. Foi anteriormente sugerido
[3] que todos os tipos de células consideradas podem ser reduzidos a três grupos, a saber: "viável" para se referir a uma célula que pode formar uma colónia na placa de agar, "vital" para se referir a um que só pode fazê-lo após a reanimação e "não viável" para se referir a uma célula que não pode fazê-lo sob qualquer condição testada. De acordo com esta terminologia, células dormentes são vitais "
(ver Tabela 2) .table 2" Glossário de termos usados para descrever os 3 grandes estados fisiológicos aqui definidos "(citado a partir de [3])
estado fisiológico
Fenótipo
viável
Capaz de divisão; irá formar uma colônia em uma placa de ágar.
Vital ou dormentes
Impossível dividir ou para formar uma colônia em uma placa de ágar sem uma fase de reanimação anterior .
não viável
Incapaz de divisão; não vai formar uma colônia em uma placa de ágar sob qualquer condição testada.
Nós usamos as frases 'fome' ou 'células famintas' para se referir às condições ambientais em que as células são incubadas, em vez de um estado fisiológico. Assim as células em jejum (ou células que sofreram outros stresses) pode ou não ser dormente. Apesar uso histórico destes termos, as frases 'contagem direta viável "e impróprios' viáveis-mas-não-cultiváveis" são, uma vez que tais células não são viáveis como definido acima.
De acordo com [4] nós definir "viável" estritamente como "capaz de crescer". A este respeito quaisquer outros testes, para testes de exemplo de alongamento (DVC; [50]) ou métodos de coloração, são meramente proxies, uma vez que nenhum tipo de coloração pode provar a viabilidade. Assim, o termo "mancha de viabilidade" é um equívoco por definição
e essas manchas devem ser corretamente chamado "manchas vitais". Infelizmente, o equívoco é frequentemente utilizado por Invitrogen Ltd. (BacLight ™), e é, portanto -, mas de forma incorrecta - adotada pelos utilizadores destes testes de vitalidade
O BacLight ™ kit viabilidade bacteriana (BacLight Ensaio, BLA)
. de acordo com o fabricante [81] BLA consiste de duas manchas, iodeto de propídio (PI) e Syto 9, que ambos os ácidos nucleicos mancha. SYTO9 é uma fluorescente verde membrana intercalando molécula permeável e mancha todas as células. Em contraste, o PI é um corante intercalante vermelho e é impermeável a membrana, e, por conseguinte, está excluído por células "saudáveis". O fabricante descreve que a PI tem uma forte afinidade para ácidos nucleicos que SYTO 9; Assim, quando os dois corantes estão presentes dentro de uma célula, SYTO 9 será deslocado a partir de ácidos nucleicos de células e o (s) irá fluorescência no vermelho. Para provar os Stocks mecanismo [82] realizou medições físico-químicas "livre de células" com a "Viabilidade Stain, Bac
Light", e poderia revelar que o princípio da coloração não é tão simples. Este autor estabelecida uma chamada de transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET), no entanto, sob certas condições de coloração, SYTO 9 emissão ultrapassa a emissão PI. O aumento da concentração SYTO 9 pode, assim, melhorar a emissão PI, causando uma dupla marcação de células. Stocks [82] enfatiza várias vezes que uma interpretação do resultado coloração "as concentrações relativas de PI, SYTO9 e DNA foram de importância crucial"
e "que controlam ou validação de experiências apropriadas (deve ser) executadas".
coloração e /ou FRET casal também foi documentado por outros autores [41, 83], que examinaram parâmetros de viabilidade de culturas viáveis e matou-formaldeído ou UVA-tratados, respectivamente. A discussão a seguir do manual sondas moleculares deve ser visto neste contexto
Em relação à confiabilidade do "kit viabilidade" utilizada na pesquisa biofilme gostaríamos de citar diretamente a folha de informações sobre o produto (s) de sondas moleculares., 2001; Informações sobre o produto Live /Dead ® Kit BacLight ™ bacteriana Viabilidade, Revisado: 26-janeiro-2001, bem como Revisto: 15-Julho-2004 (em que o último representa a versão mais atual em outubro de 2013) [81] :( I) "... manchas diferem tanto em suas características espectrais e sua capacidade de penetrar nas células bacterianas saudáveis. Quando utilizados isoladamente, a mancha SYTO 9 etiquetas geralmente todas as bactérias numa população - aqueles com membranas intactas e aquelas com membranas danificadas. Em contraste iodeto de propídio penetra apenas bactérias com membranas danificadas, causando uma redução da mancha 9 SYTO quando ambos os corantes estão presentes. Desta forma, com uma mistura apropriada dos SYTO 9 e iodeto de propídio manchas, bactérias com membranas celulares intactas mancha verde fluorescente, enquanto que as bactérias com membranas danificadas mancha vermelha fluorescente. "
(II)" Manchando bactérias com quer Kit L7007 ou L7012 - 4,1 Ajuste as suspensões de E. coli (ao vivo e morto) a 1 × 10
8
bactérias /ml ou as suspensões de S. aureus (ao vivo e morto) para 1 × 10
7
bactérias /mL. S. aureus suspensões normalmente deve ser 10 vezes menos concentrado do que E. coli para a microscopia de fluorescência. "
Daí o número de E. coli Comprar e S . aureus
diferem por um logaritmo.
(III) por último, devido a (i) uma mistura de 50% de bactérias mortas de vida e 50% normalmente não levar a um /fluorescência 50/50 verde vermelho . E vice-versa:
50% das bactérias fluorescentes verdes em uma amostra não significa que há 50% de células vitais. Portanto, "os rácios /fluorescência verde vermelho
(tem que ser) calculado para cada proporção de E. coli ao vivo /morto."
Este último ponto foi confirmada por Hannig et al . [6] no seu documento sobre a viabilidade de S. mutans in vitro
. Eles determinaram que uma "concentração inicial de bactérias viáveis no ensaio"
de 50% leva a diferentes "emissão relação vitais /bactérias mortas de emissão" valores
de cerca de 9,5, 6,5 ou 8,0 em suas amostras de NaCl de controle. Além disso, Hannig et ai. [6] afirmam que "a proporção de bactérias Avital aumentada como indicado pela razão de avital de células vitais. Ele variou entre 0,1 ... e ... 29,0 ... Após lavagem com clorexidina, a relação era de 190 (6 h) ou 10.2 (12 h) ... "
Tomando as informações de sua figura uma em consideração, ainda não está claro o que estes diferentes rácios realmente pode significar em termos de valores de vida "real".
em resumo, os três acima mencionados pontos descritos no show manual do utilizador BLA que, de acordo com Stocks [82], uma "adequada mistura
" das duas manchas deve ser determinado e estabelecido para todas as espécies únicas de bactérias antes de usá-los em um experimento. Isso pode ser possível em um in vitro
situação, onde o BLA pode ajudar a poupar tempo, a longo prazo seguir cuidado e tempo passos críticos, calibração consumir para cada espécie bacteriana individuais. No entanto, isso é impossível administrar em biofilmes que ocorre naturalmente devido à singularidade dos biofilmes matriz da placa, onde, na realidade, pode haver mais ou menos do que 1000 espécies microbianas diferentes [84]. Além disso, a aplicação do corante SYTO 9 /PI não é considerado adequado para biofilmes, devido a fenómenos de difusão, devido ao exo-polímeros que resultam em "uma subestimação de contagens viáveis"
[21].
No entanto, não parece ser uma desvantagem adicional. Giertsen et ai. [23] criticado discrepâncias consideráveis entre vitalidade biofilme esperado e o resultado do método de coloração SYTO 9 /PI. Além disso, esses autores descreveram um comportamento instável e uma mudança da cor coloração de verde para vermelho, ou seja,
para um acompanhamento mais bactérias "mortos". Apenas recentemente esses achados foram explicadas por Tawakoli et al. [7] postular que as células coradas perderam a sua viabilidade logo após a intercalação dos corantes, escrita: "Esta hipótese foi confirmada pela análise de TEM no presente estudo (Figura dois). As imagens mostraram imensa lise e destruição das células aderentes ... ".
Tabela 3 lista uma infinidade de estudos [5-7, 9, 16-20, 22, 23, 41, 71, 73], [ ,,,0],82, 83, 85-98], que usou o BLA. No entanto, em quase todos os estudos que tinha que esclarecido (a) se biofilme da placa-like, ou, pelo menos, amostras de saliva foram avaliados, ou se as investigações foram feitas com espécies bacterianas individuais e /ou (monospecies) biofilmes artificiais; (B) se o regime de coloração das amostras de biofilme foi ajustado de acordo com o manual de BLA (validação); (C) quais factor de diluição foi usada entre SYTO 9 e PI, devido a um procedimento de validação, de acordo com (b); (D) como o procedimento de incubação foi seguido, especialmente o tempo de incubação das amostras bacterianas em conjunto com a mistura dos manchas; (E) se os resultados do BLA foram comparados com outros parâmetros, e se este fosse adequada (g) ou não (F); (H) se o BLA resultados se encaixam com os outros parâmetros (seja apropriado ou não). Última não menos estávamos interessados (i) se os resultados BLA atendeu às expectativas do users.Table 3 Informações gerais a respeito do uso do ensaio BacLight® (BLA) para a avaliação da (dental) vitalidade biofilme
Estudos usando o BLA (n = 30)
[5-7, 9, 16-20, 22, 23, 41, 71, 73], [82] * [83, 85-98]
(a) foram biofilmes placa-like avaliada
No:? [5, 16-18, 22, 23, 41, 82, 83, 86], [87, 93, 96-98]
Sim: [6, 7, 9, 19, 20, 71, 73, 85], [88-92, 94, 95]
(b) validação
No: [5, 7, 9, 16-18, 20, 22, 23, 41], [71, 73, 82, 85-91, 94-98]
Sim: [6, 19 ?, 83, 92, 93?]
fator (c) diluição
Não declarado: [16, 18, 23, 73, 86, 94, 95, 98]
1: 1 [6, 7, 9, 17, 20, 22, 41, 71], [85, 87-92, 96, 97]
2: 1 [93]
4: 1 [5]
6: 4 [19]
1: 6 [83]
(d) processo de incubação
Não declarado: [16, 18, 71, 86, 95, 96]
10 min, RT [6, 7, 20]
15 min, RT [5, 9, 17, 19, 22, 23, 41, 73], [85, 87 -91, 97, 98]
20 min, RT [83, 92]
& gt; 20 min, 2 ° C [93]
30 min [94]
(e) Comparação
No: [16-18, 20, 22, 71, 82, 83, 85, 88], [90, 91, 94, 95]
Sim: [5-7, 9, 19, 23, 41, 73, 86, 87], [89, 92, 93, 96-98 ]
(f) ... com métodos inadequados
[6, 7, 9, 19, 23, 41, 73, 86], [87, 89, 92, 93, 96-98]
(g) ... com métodos apropriados
[5] *
(h) Será que resulta do BLA ajuste para o outro parâmetros
No:? [7, 19, 86, 89, 92, 93] (DAPI), [96, 97]
Sim: [5, 23, 41, 93] (FDA), [98]
(i) Será que os resultados BLA atender as expectativas do usuário (s)
no:? [23, 83, 86]
Sim: [5, 7, 16, 18-20, 22, 41, 71, 82], [85, 87-98]
(a) (i) ver descrição no texto
não declarou:. ou nenhuma informação foi dada pelos autores, ou os autores afirmaram que a coloração foi realizado "de acordo com as instruções do fabricante", o que significa geralmente um factor de diluição de 1 : 1, e um tempo de incubação de 15 minutos
* [5]:. Decker registadas as contagens bacterianas totais (como log BC /ml) e do UFC (como log CFU /ml), no entanto, não deu dados relativos ao PE .
* [82]:. medições físico-químicas "isentas de células" para elucidar o mecanismo do processo de coloração BacLight
dos 30 investigações listados na Tabela 3 uma metade (15) foi classificadas na rubrica "plaque- como biofilme ". Esta parte alta é devido ao fato de que procuramos considerar literatura sobre biofilmes orais. saliva natural, também foi incluída por exemplo
[89-91] bem como "placas microcosmos", que foram cultivadas em uma boca artificial e /ou eram por exemplo estabelecida a partir da saliva [20, 71, 92] ou a partir de uma placa subgengival amostra [96]. Alguns outros estudos tratados com bactérias do fundo do mar de sedimentos ou amostras de águas residuais [73, 93], que foram considerados por nós como sistemas multiespecíficas naturais.
É surpreendente, mas esperado, que apenas cinco estudos foram baseados em um procedimento de validação anterior (a linha (b) na Tabela 3) [6, 19, 83, 92, 93], a partir da qual dois casos foram ainda questionável [19, 93]. No entanto, a calibração poderia ser assumida lá. A descrição de Filoche et ai. [92] esclarece a metodologia trabalhoso (cf. seus Materiais & amp; seção de Métodos, parágrafos 2.5 Geração do padrão de viabilidade; 2.6 Preparação do padrão viabilidade placa indivíduo, 2,7 Preparação do padrão viabilidade centralizados; 2,8 protocolo de coloração para Live /Dead® BacLight ™ e 2,9 de medição e análise de dados de fluorescência). Surpreendentemente, o processo de calibração destes autores [92], mesmo parecia estar a trabalhar quando as amostras e controles foram fixados em paraformaldeído a 4%, e /ou foram armazenados por até três meses.
Como consequência de não ter nenhuma validação dos usuários extremos confiar nos conselhos do fabricante quanto o fator de diluição entre as duas manchas SYTO 9 e PI. Apenas quatro grupos de pesquisa não seguiu o recomendado diluição 1: 1. Curiosamente, os seus factores abrangem uma gama desde 1: 6 até 4: 1 (linha (C) no Quadro 3). Isso geralmente espelha a natureza sedutora do procedimento de coloração [13] e os pedidos dos investigadores têm para uma aplicação fácil e rápida. A preocupação dos Stocks [82] que as concentrações relativas de PI, SYTO9 e os ácidos nucleicos são de importância crucial é em grande parte negligenciado pelos usuários.
À primeira vista, o mesmo vale para o processo de incubação (linha (d) em tabela 3), no entanto, este pode ser um problema mais grave. Vinte e dois dos usuários não indicou o procedimento ou contado com as instruções do fabricante. Alguns outros reduzidos a incubação recomendado de 15 minutos para 10 minutos [6, 7, 20], enquanto outros estenderam o tempo de incubação entre as manchas BacLight e suas amostras a 20 ou mesmo 30 minutos [83, 92-94]. No entanto, a descoberta de Tawakoli et al. [7] que as células coradas sob investigação alteradas ou mesmo perdida a sua viabilidade logo após a intercalação dos corantes sugere que o tempo de incubação "simples" é um factor crucial e potencialmente destrutiva. É a questão de saber se um tempo de 10, 20 ou 30 minutos ( "no escuro", mas, à temperatura ambiente, e apenas uma vez no 2 ° C [93]) podem exercer um efeito de deterioração sobre os resultados do processo de coloração. [7]. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.
