Abstract
Em estudos recentes, a saúde periodontal tem sido associada ao excesso de peso e /ou obesidade. Entre as bactérias orais comuns, Selenomonas noxia
tem sido implicada na conversão de saúde periodontal a doença, e Selenomonas
espécies também foram encontrados em úlceras gástricas. O objetivo deste estudo foi desenvolver e validar uma reação em cadeia da polimerase quantitativa ensaio (qPCR) para a detecção específica e rápido de S. noxia
.
Métodos
Dois pares de oligonucleótidos iniciadores e uma sonda foram concebidos e testado para determinar sinal de amplificação ideal com três cepas de S. noxia
. O ensaio de PCR foi testado contra catorze organismos não-alvo, incluindo Selenomonads orais intimamente relacionadas, uma bactéria filogeneticamente intimamente relacionado, e duas bactérias orais comumente isoladas.
Resultados
Um dos conjuntos de iniciadores foi mais sensível na detecção do alvo organismo e foi selecionado para a otimização e validação experimentos. Os iniciadores desenhados e sonda amplificada do organismo alvo com 100% de especificidade. inibição de PCR foi observada com um controlo positivo interno, e a inibição foi resolvido através da diluição do extracto de ADN.
Conclusões O ensaio qPCR concebida neste estudo pode ser usado para detectar especificamente S. noxia
no cenário clínico e em pesquisas futuras envolvendo a detecção avançada de S. noxia
. O ensaio também pode ser utilizado em estudos epidemiológicos para compreender o papel de S. noxia
em processos de doença, incluindo, mas não se limitando a, saúde oral e obesidade de origem infecciosa. Palavras-chave
Bactérias saúde e doença periodontal Selenomonas noxia
Fundo PCR of the genus Selenomonas
foi descrita pela primeira vez em 1683 por Antony Van Leeuwenhoek como uma bactéria em forma de crescente a partir de uma amostra oral [1]. Selenomonas noxia
é uma bactéria que coloniza a cavidade oral humana, e tem sido repetidamente associados com a doença periodontal [2-4]. Esta espécie está composta por anaeróbica obrigatoriamente, móvel, não-formadoras de esporos, gram negativas hastes [5]. S. noxia
estava entre as cinco novas espécies do gênero Selenomonas
, Filo Firmicutes, caracterizado pela primeira vez por Moore et al
. em 1987 [5]. As doenças periodontais são, provavelmente, uma das infecções bacterianas mais comuns em humanos. Apenas algumas das várias centenas de espécies de microrganismos que tenham sido identificados dentro do sulco gengival da bolsa periodontal e são pensados para desempenhar um papel importante na iniciação e progressão da doença [6], e S. noxia
estava entre o novos organismos adicionados como um agente patogénico periodontais [7]. Muito pouca literatura está disponível na patogenicidade de S. noxia
, mas o género Selenomonas
foi encontrado em maiores proporções em comparação com outras bactérias orais em casos de periodontite agressiva generalizada (GAP). Além disso, S. noxia
foi detectada utilizando a cultura e as técnicas em ambos os periodontite crônica (PB) e GAP lesões DNA baseada em [8, 9]. Em um estudo conduzido por Kumar et al.
[10], as amostras associados à doença foram coletadas em quatro locais mais profundos em indivíduos com periodontite estabelecida, e as espécies mais numerosas por 16S análise clonal pertencentes aos gêneros Selenomonas
, Streptococcus
, Veillonella
, Campylobacter
e Peptostreptococcus
. Enquanto Selenomonas
clones orais não foram associados com a doença [8], outros estudos têm sugerido que S. noxia
está entre as principais espécies associados a sites de conversão de saúde periodontal à doença periodontal [3, 11]. Além disso, em um relatório recente da Andersen et al.
[12], a Helicobacter
-Como organismo (HLO) em cortes histológicos de uma úlcera gástrica humano foi encontrado para ser um Selenomonas
espécie. A literatura e os estudos realizados até à data não dar dados precisos sobre a prevalência global de S. noxia
em indivíduos saudáveis.
Técnicas moleculares têm fornecido uma boa base para identificar o papel de Selenomonas
espécies como a saúde periodontal indicadores [8, 13]. Em um estudo utilizando sondas oligonucleotídicas que visam a maioria de todos os isolados orais para explorar a distribuição espacial da Selenomonas
espécies em biofilmes subgengivais, uma prevalência relativamente baixa de Selenomonas
foi mostrado na GAP e pacientes com PC. No entanto, uma análise do mesmo biofilme in situ de fluorescência
fluorescente (FISH) mostrou que Selenomonas
feita uma contribuição para a organização estrutural dos biofilmes [9].
Além do papel do S . noxia
na saúde oral, um estudo realizado por Goodson et al.
[14] implicava que S. noxia
pode ser associada à obesidade. O estudo demonstrou que 98,4% dos indivíduos com excesso de peso foram correctamente identificados pela presença de uma única bactéria, S. noxia
. Esta descoberta forneceu um indício para melhor compreender a associação e /ou a presença de S. noxia
na cavidade oral e o desenvolvimento de obesidade. Recentemente, tem havido um crescente interesse em compreender a relação entre a diversidade microbiana humana e estar acima do peso ou obesos. Considerando-se a probabilidade de que a doença periodontal pode contribuir para o desenvolvimento da obesidade, o papel da microbiota oral em obesidade tem vindo a ganhar mais atenção [14]. O mecanismo pelo qual as bactérias orais contribuir para o desenvolvimento da obesidade é explicado em pelo menos três maneiras: aumentando a eficiência metabólica, aumento do apetite, e /ou o redirecionamento do metabolismo da energia [14]
A crescente importância clínico e epidemiológico de S. noxia.
requer o desenvolvimento de um método de detecção rápida. Até agora, os métodos de detecção de S. noxia
limitaram-se a testes de hibridização de cultura e de DNA. análise de cultura de Selenomonas
spp. não é comum no laboratório microbiológico clínica e pode levar tempo porque é uma bactéria anaeróbica obrigatoriamente fastidioso. Com a técnica de cultura anaeróbica, a discrepância entre a recuperação salivar e presença subgengival foi significativa, o que torna esta abordagem inadequada para utilização no diagnóstico de pacientes com periodontite microbiana [15]. Usando a técnica de reacção em cadeia da polimerase de detecção (PCR) com iniciadores e sondas de oligonucleótidos específicos pode melhorar a detecção rápida de S. noxia
. O método de PCR quantitativa (qPCR) combina a química de PCR com detecção por sonda fluorescente de produto amplificado no mesmo recipiente de reacção, e é completada em duas horas ou menos. O objetivo deste estudo foi desenvolver e validar um ensaio de qPCR para a detecção específica de S. noxia
. detecção melhorada do Selenomonas noxia
na microflora oral é o primeiro passo para elucidar seu envolvimento na obesidade e doenças humanas.
Métodos
organismos de teste
três estirpes diferentes de S. noxia
foram obtidos a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) e utilizado para avaliar o protocolo de PCR concebido (Tabela 1). Catorze organismos não-alvo, incluindo outros Selenomonads orais estreitamente relacionada, bactéria filogeneticamente relacionados, e duas bactérias orais vulgarmente encontrados,
foram obtidas a partir da ATCC e utilizadas para testar a especificidade dos iniciadores desenhados e sonda (Tabela 1). tabela 1 organismos de ensaio
espécies bacterianas
ATCC #
Bacillus cereus
14579
Candida albicans
14053
Centipeda periodontii
35019
Klebsiella pneumoniae
4352
Lactobacillus acidophilus
3456
Pectinatus cervisiiphilus
29359
Pseudomonas aeruginosa
27853
Selenomonas artemidis
43528
Selenomonas dianae
43527
Selenomonas flueggei
43531
Selenomonas infelix
43532
Selenomonas noxia
43541
Selenomonas noxia
51893
Selenomonas noxia
700.225
Selenomonas sputigena
35185
Staphylococcus aureus
25923
Streptococcus mutans
25175
extração de DNA
ADN microbiano foi extraído utilizando o Kit QIAamp® DNA Mini ( Qiagen, Valencia, CA) de acordo com as instruções do fabricante, com as seguintes modificações; 100 ul de volume da amostra foi utilizado para extracção e o volume de eluição final foi de 200 uL. amostras seleccionadas foram extraídas com o UltraClean® Kit de Isolamento de DNA do solo (Mobio, Carlsbad, CA). Os extractos de ADN foram armazenados a -70 ° C até estar pronto para usar.
A presença e quantidade de ADN em cada amostra foi medida com um espectrofotómetro Spectronic Genesys 10 ™ Bio UV-Visível utilizando o acessório nanocélula-0,2 milímetros comprimento da trajectória (Thermo Electron Corporation, Madison, WI) para analisar amostras de ADN sub-microlitros em solução. O ensaio foi realizado com 1,5 ul de amostra de teste, depois de ter sido colocado no zero com tampão Tris-EDTA (TE) (pH 7,4). Modo de DNA /proteína concentração (absorvância a 260 e 280 nm com correcção 320 nm) foi usado para a medição. As concentrações de ADN em S. noxia
(ATCC 43541, ATCC 700225 e ATCC 51893) foram entre 4,2 e 11,7 ng /mL. As concentrações variaram de 4,2-150,8 ng /mL nas amostras não-alvo (dados não apresentados). concentrações de matriz de ADN utilizada para a PCR variada, mas foram suficientes para se obter um resultado positivo num teste de presença /ausência, com base na sensibilidade do ensaio (583 fg /reacção).
Primer e design of the sonda de codificação de nucleótidos dados de sequência região e sequenciamento de genoma inteiro de S. noxia
foram recuperados do National Center for Biotechnology Information, NCBI (http:.... //www NCBI NLM nih gov /Genomas /) . montagem da seqüência e alinhamento foram comparadas in silico
contra todas as sequências disponíveis on-line com o algoritmo Básico Local Alignment Search Tool (BLAST, NCBI).
O 16S RNA ribossomal (1491 pares de bases) de S. noxia
(ATCC 43541) foi seleccionada para conceber iniciadores e sondas específicas comparando a região V8 deste gene (Tabela 2). Esta região é altamente conservada entre os membros da Selenomonas
género, mas mais variável entre Selenomonas
espécies. primers e sondas TaqMan ® foram concebidos e analisados utilizando o software Primer Express versão 3 (Life Technologies [Applied Biosystems], Foster City, CA). iniciadores seleccionados foram rastreados contra a formação de estruturas secundárias, incluindo formação de estruturas em grampo, e auto-e cross-dímeros. O comprimento do iniciador, temperatura de fusão (T
m), a relação de G-C e de outros factores foram definidos como padrões na escorva expresso software.Table 2 múltiplos alinhamentos de V8 regiões do gene 16S rRNA de Selenomonas
espécies. Numeração utilizada de acordo com coli
gene 16S rRNA Escherichia [31]
Espécies
ATCC região #
V8 (pb 1268-1296)
S. noxia
43541
CAGAGGGCAGCGAGAGA-GTGATCTTAAGC
S. artemidis
43528
..... A .........-. CCC.C..GGGC ....
S. flueggei
43531
....... A .......- .. GC.C..G.CGG ...
S. infelix
43532
..... A .........-. CCC.C..GGGC ....
S. sputigena
35185
..... A ................-. C ..........
S. dianae
43527
..... A .........-. CCC.C .. GGGC ....
Dois pares de primers e uma sonda foram selecionados para teste; i) Primer Set 1: Atacante SNF1 Primer-, TCTGGGCTACACACGTACTACAATG (25 pb) e Reverse Primer- SNR1, GCCTGCAATCCGAACTGAGA (20 pb), ii) Primer jogo 2: SNF2 Primer- Adiante, GCATGTAAAGATGGGCACTCAA (22 pb) e Reverse Primer- SNr2, CCGAACTGAGAAACGGTTTTTG (22 pb); com comprimentos de amplicon de 97 e 175, respectivamente. A sonda (SNP) seleccionado para os dois conjuntos de primers foi marcado na extremidade 5 'com o corante repórter 6-carboxifluoresceína (FAM) e a extremidade 3' com o corante repórter tetrametil-6-carboxirrodamina (TAMRA), SnP, [ ,,,0],6 ~ FAM] CAGAGGGCAGCGAGAGAGTGATCTTAAGC [TAMRA]. Os iniciadores e sonda concebida foram obtidos a partir de Eurofins MWG Operon (Huntsville, AL). Ambos os conjuntos de iniciadores foram testados com DNA de dois S. noxia
cepas de referência (ATCC 43541 e 51893) para determinar o sinal de amplificação ideal.
Selecção Primer e otimização PCR
nove combinações diferentes, entre 0,2 m e 0,9 uM, dos iniciadores directo e inverso, e cinco concentrações diferentes de sonda que vão desde 0,05 uM a 0,25 uM foram testados com ADN (600 pg) de S. noxia
estirpe de referência ATCC 51893 para determinar o sinal de amplificação óptima. Os parâmetros dos ciclos de PCR foram como se segue: passo inicial de incubação de 50 ° C durante 2 min, a desnaturação do ADN molde a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos a 95 ° C durante 15 seg e 60 ° C durante 1 min . As condições de PCR foram: 1 X TaqMan Universal PCR Master Mix AmpErase® contendo UNG (uracilo-N-glicosilase), polimerase de ADN AmpliTaq ouro, trifosfatos de desoxinucleósidos, passiva de referência interno [corante ROX ™], e os componentes do tampão optimizados (Applied Biosystems), iniciadores ( SNF1 e SNR1or SNF2 e SNr2) para uma concentração final de 0,9 uM, sonda para uma concentração final de 0,2 uM, e 5 ul de ADN molde. água estéril livre de nuclease (Promega, Madison, WI) foi utilizado para ajustar o volume de cada reacção a 25 uL. As análises foram realizadas em placas de 96 poços utilizando um 7900HT rápido em tempo real instrumento sistema de PCR (Applied Biosystems) no modo standard. Os controlos negativos, contendo 5 mL de água livre de nuclease, em vez de DNA foram incluídos em cada série para detectar qualquer contaminação cruzada DNA. DNA extraído de S. noxia
serviu como controlo positivo em cada execução PCR
controlo de amplificação interno
A TaqMan exógena Interno Controle Positivo disponível no mercado. (IPC; Applied Biosystems) foi utilizado para detectar a inibição da PCR. O kit de reagentes incluídos 10X exógena IPC Primer e mistura Probe (VIC ™ Probe), 10X exógena IPC reagente de bloqueio, e DNA IPC 50X exógena. O ensaio qPCR foi optimizado para as condições adequadas para a detecção de ambos o organismo alvo e o controlo positivo interno; Assim, a ausência ou redução de amplificação do ADN de IPC em cada reacção de PCR multiplex indicou a presença de inibidores de PCR. Várias diluições (i.e., 10 -1 10 -6) de cada amostra de ADN foram testados, para determinar e eliminar inibidores potenciais de PCR. Um espectrofotómetro com o acessório nanocélula foi utilizado tal como indicado acima, para demonstrar a presença de ADN de PCR em amostras negativas não-alvo.
Análise de Dados
replicar amplificações de PCR foram realizadas (n = 4). Uma vez que a amplificação foi completada, os dados foram analisados e representados graficamente (fluorescência versus número do ciclo) usando o software fornecido com o instrumento 7900HT PCR. O nível de amplificação foi relatado pelo software como o limiar de ciclo médio (Ct) de amostras em replicado. Ct refere-se ao ciclo de PCR em que a fluorescência (i.e., produto de amplificação) é detectado pela primeira vez, e é inversamente proporcional à concentração inicial de matriz de ADN. Um valor Ct de 40 não representa DNA alvo presente.
Resultados
Primer e de design sonda
Os resultados da proteína da família Sorter (PFS) usando Patric mostrou 14 proteínas únicas para S. noxia
, mas o BLAST de proteínas não encontrou uma saída confiável para projetar o primer /sonda se nesta região. Portanto, os conjuntos de iniciadores foram desenhados utilizando a sequência de ARNr 16S [GenBank: AF287799]. Ambos os conjuntos de primers, primer set 1 (SNF1, SNR1) e primer set 2 (SNF2, SNr2) amplificou o organismo alvo. O conjunto iniciador 1 foi encontrada para produzir os menores valores de Ct, indicando que foi mais sensível na detecção de alvo do organismo (Tabela 3). Portanto, este conjunto de primers foi selecionado para otimização adicional e experiments.Table validação 3 resultados PCR quantitativo para S. noxia
detecção
organismo alvo
Primer Set Online Factor de diluição
100
10-1
10-2
média do limiar de ciclo (Ct) valor de ± SE (N = 2)
S. noxia
(ATCC 43541)
1
11,68 (0,56)
14,99 (0,42 )
17,97 (0,02)
2
13,55 (0,95)
15,51 (1,12)
18,21 (0,16 )
S. noxia
(ATCC 51893)
1
9,39 (0,10)
13,56 (0,08)
16,91 (0,11)
2
11,66 (0,44)
13,35 (0,28)
17,23 (0,11)
PCR otimização
os nove combinações diferentes de concentrações de primers testados produziram sinal de amplificação ideal em cinco das nove combinações, variando entre 19-20 valores Ct para a 0,2 � /0,9 mM, 0,5 /0,5 mM, 0,5 /0,9 uM, 0,9 /0,5 ^ M, e 0,9 /0,9 uM para a frente e reverso concentração de iniciador, respectivamente (dados não mostrados). Resultados da optimização sonda mostraram que três dos cinco concentrações diferentes (isto é, 0,15 uM, 0,2 uM e 0,25 uM) produziu os menores valores Ct (& lt; 20) (dados não mostrados). Tal como recomendado pelo fabricante do instrumento e software, 0,9 uM directo e inverso concentração de iniciador e 0,2 uM de concentração de sonda foram seleccionadas para testes de especificidade. O limite de detecção inferior do noxia
ensaio de PCR Selenomonas (usando S. noxia
ATCC 51893 como organismo de teste) foi 583 fg /reação.
Especificidade Testes
amplificação PCR quantitativa do organismo alvo usando os iniciadores e as sondas, as condições de reacção e parâmetros de ciclagem acima descritas resultou na amplificação do fragmento de 97 pb esperado a partir dos três S. noxia
estirpes testadas (Tabela 4). O não-alvo Selenomonas
spp. testado não amplificou com os primers desenhados e sonda. Os restantes organismos não-alvo também não foram amplificados com o ensaio 16S qPCR desenvolvidos (Tabela 4) testes .table 4 Especificidade de S. noxia
ensaio qPCR
organismo Teste
ATCC #
resulta
PCR
Bacillus cereus
14579
negativo
Candida albicans
14053
negativo
Centipeda periodontii
35019
negativo
Klebsiella pneumoniae
4352
negativo
Lactobacillus acidophilus
3456
negativo
Pectinatus cervisiiphilus
29359
negativo
Pseudomonas aeruginosa
27853
negativos
Selenomonas artemidis
43528
negativo
Selenomonas dianae
43527
negativo
Selenomonas flueggei
43531
negativo
Selenomonas infelix
43532
negativo
Selenomonas noxia
43541
positiva
Selenomonas noxia
51893
positiva
Selenomonas noxia
700.225
positiva
Selenomonas sputigena
35185
negativo
Staphylococcus aureus
25923
Negative
Streptococcus mutans
25175
inibição da PCR negativo
O gene alvo foi amplificada em todas as concentrações de DNA testadas de três S. noxia
estirpes. No entanto, o IPC PCR demonstrou a presença de inibição da PCR, e estes extractos de ADN necessária diluição (10 -4 a 10 -5) para remover os inibidores (Tabela 5) 5 .table resultados de PCR que mostra a inibição em S . noxia
amostras
resultados
PCR (valores Ct)
Amostra
diluição
Amostra
IPC
S. noxia
(ATCC 43541)
100
14,60
15.01
40,00
40,00
10-1
17,76
17,94
40.00
40,00
10-2
21.30
21.23
40,00
40.00
10-3
24.79
24,71
40,00
31,21
10-4
28,13
28,01
28,08
28,11
S. noxia
( ATCC 51893)
100
13,36
13,24
40,00
40,00
10-1
15,34
15.45
40,00
40,00
10-2
19,59
19,26
40,00
40,00
10-3
22,54
23,05
40,00
40,00
10-4
28.29
28,23
40,00
40,00
10-5
30,80
30,77
28,08
28,93
S. noxia
(ATCC 700225)
100
20,90
20,00
40,00
40,00
10-1
ND1
ND1
ND1
ND1
10-2
22,92
23,00
40,00
40,00
10-3
26,68
26,48
40,00
40,00
10-4
29.95
30.11
28,53
28,22
10-5
33,53
33,53
27,73
28,06
Não controle de modelo
40,00
40,00
28,40
28,12
1Não determinada
diluições (10 -1 a -6) foram necessários para remover os inibidores em extractos de DNA não-alvo (Tabela 6) 10. Na ausência de inibição, o ADN de IPC (isto é, sem controlo de modelo) amplificado com um valor médio do Ct de 29,4 ± 0,3 (erro padrão; D.P.). Foi necessário diluir as amostras de ADN todo, alvo e não alvo, para remover os inibidores. Todos os extratos de DNA não-alvo produziu resultados negativos (TC = 40) para o S. noxia
ensaio de PCR mesmo quando inibidores da PCR tinha sido removido por diluição da amostra. Estas amostras negativas de PCR não-alvo contido ADN como demonstrado espectrofotometricamente com o acessório nanocélula (dados não mostrados) .table 6 Dados mostrando diluição à qual a inibição foi resolvido (n = 2 para todas as amostras, excepto aqueles em negrito, que consistia de quatro repetições)
resultados da PCR (valor médio Ct)
Amostra
diluição
IPC
Bacillus cereus
1,00E + 00
40.00
1.00E-02
40.00
1.00E-04
40.00
1.00E-05
31.43
1,00E-06
29,48
Candida albicans
1,00E + 00
40,00
1,00E-01
30,76
Centipeda periodontii
1,00E + 00
40,00
1,00E-02
40,00
1,00E-03
40,00
1,00E-04
29.01
Klebsiella pneumonia
1,00E + 00
40,00
1,00E-01
30,42
Lactobacillus acidophilus
1,00E + 00
40,00
1,00E-01
40,00
1,00E-02
40,00
1,00E-03
29,84
Pseudomonas aeruginosa
1,00E + 00
40,00
1,00E-01
30,47
Pectinatus cerevisiiphilus
1,00E + 00
40,00
1,00E-01
40,00
1,00E-02
40,00
1,00E-03
28,70
Staphylococcus aureus
1,00E + 00
40,00
1,00E-02
40,00
1.00E- 03
29,73
Selenomonas artemidis
1,00E + 00
40,00
1,00E -01
40,00
1,00E-02
40,00
1,00E-03
28,72
Selenomonas dianae
1,00E + 00
40,00
1,00E-01
40.00
1,00E-02
40,00
1,00E-03
28,22
Selenomonas flueggeii
1,00E + 00
40,00
1,00E-01
40,00
1,00E-02
40,00
1,00E-03
28,82
Selenomonas infelix
1,00E + 00
40,00
1,00E-01
40,00
1,00E-02
29.32
Streptococcus mutans
1,00E + 00
40,00
1,00E-01
< Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.
