epiteliais orais da arte abstracta
Fundo
células epiteliais gengivais são a maior população do tecido gengival, atuando como a defesa de linha de frente contra a invasão microbiana e regulando a homeostase do tecido periodontal na saúde e na doença através da família NLR pyrin-3 contendo domínio (NLRP3) inflammasome, que reconhece padrões moleculares pathogen- e associada ao perigo (PAMPs e amortece). O objetivo deste estudo foi determinar se a ativação de NLRP3 inflammasome depende de infecção com o patógeno periodontal Porphyromonas gingivalis
(P. gingivalis
), ou a estimulação com P. gingivalis
lipopolissacarídeo (LPS), e /ou extracelular de adenosina trifosfato (ATP).
Métodos
Uma linha de células epiteliais oral foi tratado com P. gingivalis
, P. gingivalis
LPS e ATP. A expressão do gene e proteína de componentes inflammasome NLRP3 foram quantificados por tempo real de RT-PCR e imunotransferências. Produção de IL-1β e IL-18 foi medida por ELISA.
Resultados Não houve aumento na expressão do gene inflamassoma NLRP3 após P. gingivalis
infecção, a menos que pré-estimuladas por ATP. observou-se aumentos evidentes de expressão do gene inflammasome NLRP3 após P. gingivalis
estimulação LPS, mesmo pré-estimuladas pela ATP a 2 h.
Conclusões
Os resultados indicam que a ativação de NLRP3 inflammasome não depende de P . gingivalis
infecção, a não ser estimulada por LPS de P. gingivalis
e /ou ATP extracelular, sugerindo diversas vias de sinalização estão envolvidas na resposta imune do hospedeiro. Palavras-chave
extracelular de adenosina trifosfato inflamassoma (ATP) NLRP3 Porphyromonas gingivalis
(P. gingivalis
) P. gingivalis
Fundo LPS
periodontite crônica, uma das doenças mais comuns e prevalentes em seres humanos em todo o mundo [1], é definido como uma crónica orientada por infecção doença inflamatória do periodonto resultando na destruição do tecido gengival, absorção de osso alveolar e perda de dente, eventualmente, [2]. Quando a infecção ocorre, o sistema imune inato será a primeira linha de defesa contra agentes patogénicos e activa o sistema imunitário adaptativo para protecção sustentada de tais invasões [3].
Os complexos de multi-proteínas intracelulares, conhecidos como "inflammasomes NLR" desempenham um papel central na imunidade inata. Entre inflammasomes, o domínio contendo-3 (NLRP3) inflamassoma pyrin é o mais estudado [4]. células epiteliais gengivais expressar uma inflammasome NLRP3 funcional que pode ser ativado por padrões moleculares pathogen- ou associada a perigo (PAMPs ou amortece) [4]. NLRP3 é montado com o adaptador de ASC proteína (proteína associada Speck-como-apoptose) em um complexo multi-proteína que regula a activação da caspase-1 e subsequente maturação do de citocinas pró-inflamatórias interleucina (IL) -1β e /ou IL-18 na resposta do hospedeiro à infecção periodontal [4]. células epiteliais gengivais pode detectar e reconhecer MMAPs ou amortece [5], através da estimulação de receptores de reconhecimento de agente patogénico (PRRs) [1, 3], com subsequente libertação de citoquinas pró-inflamatórias IL-1 e IL-18 [6]. O trabalho fundamental de Bostanci et al. [7] indicou pela primeira vez que inflammasomes NLR estão envolvidos na doença periodontal, que as respostas ao P. gingivalis
infecção clínicos e in vitro
estudos.
Interleucina-1 (IL-1β), uma citocina pró-inflamatória pertencente a família da IL-1, é crítico na defesa do hospedeiro contra as infecções microbianas [5] e regula respostas imunes inatas e inflamatórias. IL-18 é outra citocina pró-inflamatória que pertence à família de IL-1 [6] e foi recentemente descrito como um elemento importante no sistema inflamassoma que activa da caspase-1 e leva à activação do processo de inflamação. Estudos recentes demonstraram que a maturação e secreção de IL-1β e IL-18 são regulados pelo complexo inflamassoma NLRP3 que contém o andaime NLRP3, a caspase-1 e proteína Speck apoptótica contendo um domínio de recrutamento de caspase C-terminal (ASC) [8 ]. O excesso de IL-1β e IL-18 contribuem para um aumento do número de respostas inflamatórias humanas [9]. Embora a IL-1β e IL-18 pertence à mesma família de citoquinas, a sua expressão e secreção de genes são regulados diferencialmente em células monocíticas humanas em resposta a P. gingivalis
[10]. Portanto, citoquinas da família IL-1, podem participar através de diferentes vias
na patogénese da periodontite complexa [10].
P. gingivalis
, uma bactéria anaeróbia gram-negativos [11], foi confirmado ser um agente patogénico periodontal predominante [12] e produz um número de factores de virulência potenciais para perturbar o sistema de defesa do hospedeiro [13] e induzem uma resposta inflamatória em doenças periodontais [14]. No entanto, o efeito de P. gingivalis
na activação do inflamassoma NLRP3 permanece controverso. O lipopolissacárido (LPS), como o componente da parede celular principal de P. gingivalis
[15], é considerada como um importante factor de virulência eliciar a resposta inflamatória na doença periodontal [16]. Parece ser unanimemente acordado que o tratamento com LPS de fagócitos mononucleares, [17] [18] macrófagos e células epiteliais oral [19] induz significativamente a expressão de NLRP3 e pro-caspase-1, tanto o ARNm e os níveis de proteína. Estudos têm demonstrado que qualquer polimorfismo funcional em LPS-receptores afecta o processo inflamatório e os resultados clínicos de doença periodontal [20]. Os resultados descritos acima sugerem que gingivalis inteiras de P. gingivalis e P.
LPS pode ter diferentes efeitos sobre a activação do sistema inflamassoma NLRP3.
Extracelular ATP (adenosina trifosfato), um dos primeiros activadores descritos para induzir a formação inflammasome NLRP3, é atribuída ao grupo de Damps endógenos lançado pela morrendo ou feridos células [21, 22]. A sua presença é negligenciável em tecidos saudáveis, mas pode aumentar para níveis micromolares elevados em resultado de danos dos tecidos em locais de inflamação [23]. Estudos têm mostrado induzida ATP activação da caspase-1 e subsequente libertação de IL-1β [24, 25]. Além disso, Özlem et ai. demonstraram que a IL-1β não foi segregada, a menos que LPS-tratadas ou células epiteliais gengivais infectados (GECS) foram subsequentemente estimulado com ATP, e que o ATP não teve qualquer efeito adicional no NLRP3 ou expressão ASC em P. gingivalis
infectados GECS [26] . Estes resultados apontam para a necessidade de avaliar melhor o papel do ATP na activação inflamassoma NLRP3.
Portanto, a activação do complexo inflamassoma NLRP3 num modelo de células epiteliais cultivadas por via oral P. gingivalis
infecção, ou P. gingivalis
LPS, ou estimulação de ATP foi testado. Isto proporcionou uma maior compreensão do mecanismo subjacente a inflamação periodontal.
Métodos
cultura de células epiteliais bucais
A linha celular epitelial (H413) derivado de um carcinoma humano de células escamosas orais [27], apresenta morfologia celular epitelial estratificado em cultura. H413 linhas celulares clonadas foram estabelecidos utilizando um método de diluição limite, como descrito anteriormente [28]. As células clonadas foram cultivadas em Meio Essencial Mínimo (JMEM, modificação Joklik, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) de Eagle, penicilina /estreptomicina (100 IU /ml, Sigma) e 10% de soro fetal de vitelo (FCS, CSL Limited , Victoria, Austrália) a 37 ° C em 5% de CO
2 [29]. As culturas foram recolhidas com expressa triplo (substituição para a tripsina, Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) em PBS e sub-cultivadas a cada 3 dias.
Cultura de células bacterianas
Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277) foi cultivado anaerobicamente durante 24 h a 37 ° C em caldo de tripticase de soja suplementado com hemina (5 mg /ml, Sigma) e menadiona (1 mg /ml, Sigma). No dia de tratamento com células, as bactérias foram centrifugadas a 5000 rpm e 4 ° C durante 15 min, lavadas duas vezes e ressuspensas em PBS frio, pH 7,3.
Tratamento celular
culturas de células confluentes H413 (5 × 10 6 células em T-25 cm 2 frascos) foram lavadas três vezes com PBS e infectados com P. gingivalis
a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 100 células bacterianas por uma célula epitelial [30 ] durante 2 4 h e [31, 32], ou foram estimuladas com 1-ig /mL ultrapura lipopolissacarídeo (LPS) a partir de P. gingivalis
(Invivogen, San Diego, CA, EUA) em meio de crescimento de células para 2 e 4 h. As células não infectadas e não estimuladas serviram como controlos.
experiências também foram realizadas após pré-incubação das células com 5 mM de adenosina-trifosfato (ATP) (Invivogen) durante 3 h antes da infecção com P. gingivalis
ou estimulação com P. gingivalis
LPS durante 2 e 4 horas. As células pré-incubadas com ATP 5 mM durante 3 h foram como controlos para estes grupos.
Isolamento de ARN e quantitativo em tempo real de RT-PCR
Após o tratamento, as células foram colhidas em 1 ml de reagente Trizol (Invitrogen) e ARN extraído de acordo com o protocolo de Trizol. Para a transcrição reversa, os cDNAs da primeira cadeia foram sintetizados com oligo (dT) 12-18 (Invitrogen), dNTP 10 mM (Promega, Madison, WI, EUA), 5 × tampão de primeira posição, RNaseOUT ™ recombinante Inibidor de RNase (Invitrogen) e SuperScript ™ III transcriptase reversa (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante.
iniciadores para genes que codificam componentes inflammasome (NLRP3, ASC e caspase-1) e as citocinas IL-1 e IL-18 (Tabela 1) foram concebidos utilizando o software Oligo Explorer (1.1.0) e sintetizados por tecnologias de ADN integradas (IDT, Coralville, IA, EUA). Análises em tempo real de RT-PCR foram realizadas por ensaios com base SYBR Green utilizando o MXPRO-Mx3005P Sistema de Stratagene (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA). As reacções de PCR foram realizadas com 2 uL de amostras de cDNA diluído, 200 nM de cada um dos respectivos iniciador directo e inverso, numa mistura reaccional de 20 ul final com platina SYBR Green qPCR SuperMix UDG-(Invitrogen). amostras de cDNA isoladas a partir de células H413 do clone-1 não manipulados foram quantificados por PicoGreen kit (Invitrogen) e, em seguida, utilizada para construir curvas-padrão (2-2000 pg) por referência à expressão do gene que codifica house keeping β-actina. As reacções de PCR para cada gene foram realizadas em triplicado em placas de 96 poços, e iniciadas por activação a 95 ° C durante 2 min, seguido de 40 ciclos de PCR de desnaturação a 95 ° C durante 15 s, emparelhamento e extensão a 60 ° C durante 30 s. Os resultados foram analisados usando MXPRO 4,10 software.Table 1 Primers utilizados para real-time RT-PCR
Genes
Oligos
Primers5'-3 '
Esperado amplicon tamanho
números UniGene
NLRP3
F-primário
GCTGGACCTGAGTGACAAC
151 bp
Hs.159483
R-primer
GCTGAGTACCGAGGACAAAG
ASC
F-primer
AGGCCTGCACTTTATAGACC
174 bp
Hs.499094
R-primer
GCTGGTGTGAAACTGAAGAG
caspase-1
F-primer
GAAAAGCCATGGCCGACAAG
205 bp
Hs.2490
R-primer
GCCCCTTTCGGAATAACGGA
IL-1β
F-primer
GGCCCTAAACAGATGAAGTG
90 bp
Hs.126256
R-primer
GTAGTGGTGGTCGGAGATTC
IL-18
F-primer
GCATCAACTTTGTGGCAAT
161 bp
Hs.83077
R-primer
CCGATTTCCTTGGTCAAT
β-actin
F-primer
ACTCTTCCAGCCTTCCTTC
216 bp
Hs.520640
R-primário
GGAGCAATGATCTTGATCTTC
Imuno-ELISA para quantificar os níveis de IL-1β e IL -18
Um sanduíche padrão de ensaio ligado a enzima imuno-sorvente (ELISA) foi usado para medir a produção de citocinas de IL-1β e IL-18. Resumidamente, sobrenadantes de teste (tratados com P. gingivalis
, P. gingivalis
LPS, ATP + P. gingivalis
ou ATP + P. gingivalis
LPS) e culturas de células de controlo foram coletados em cada hora ( 1, 2, 3, 4, 5, 6 h), em seguida, as partículas removidas por centrifugação e analisado imediatamente ou divididos em alíquotas e armazenado a -20 ° C. Human IL-1β e IL-18 monoclonal específico e anticorpos policlonais (1 ug /ml) foram pré-revestidos para ligação elevada placas de 96 poços (Corning Incorporated, EUA) em tampão de carbonato (pH 9,0) a 4 ° C durante a noite. Depois de remover a solução de revestimento e lavar a placa três vezes com 200 ul de PBS /cavidade, com a placa foi bloqueada com albumina de soro bovino 3% (BSA, Sigma) a 4 ° C durante a noite. As amostras de teste foram adicionadas a cavidades em triplicado durante 90 minutos à temperatura ambiente, e seguida por lavagem com 0,05% de Tween 20 /PBS (TPBS) três vezes; em seguida, incubadas com o anticorpo secundário (IgG de murganho /coelho de cabra-anti, (DAKO, Glostrup, Dinamarca) conjugado com fosfatase alcalina (AP)) diluído 1: 1500 em TPBS durante 2 h à temperatura ambiente, em seguida, lavou-se com tampão 3 vezes TPBS. Os conjugados ligados foram detectados por pNPP (p-nitrofenil-fosfato) e a absorvância medida a 405 nm num leitor de microplacas (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) após 15-30 min de incubação à temperatura ambiente. As reacções foram interrompidas por adição de um volume igual de NaOH a 1,00 M. A IL-1β humana e a concentração de IL-18 das amostras foram interpretados a partir de uma curva padrão.
Imunotransferência para proteínas NLRP3, ASC e caspase-1 | Para medir a expressão de proteína inflamassoma, 2- e 4-H de culturas as diferentes condições (tratados com P. gingivalis
, P. gingivalis
LPS, ATP 3 h + P. gingivalis
ou ATP 3 h + P. gingivalis
LPS) foram extraídas em tampão de amostra de SDS e separadas por PAGE, utilizando o gradiente 5% a 12 mini-geles, transferidos para membranas de nitrocelulose (Bio-Rad) e bloqueadas durante a noite com 3% de BSA (Sigma) em 0,1 M de Tris tamponada com solução de sais a pH 7,4 (TBS). antigénios riscados foram incubadas com anticorpo policlonal de coelho anticorpos anti-humanos CIAS1 /NALP3, TMS1 /ASC, caspase-1 (1 ng /ml, Abcam, Cambridge, Reino Unido), e β-actina (0,1 ug /ml, Gentex, Zeeland, MI , EUA) como um controlo de carga em 0,05% de Tween 20 /TBS durante 4 h, lavadas três vezes e subsequentemente incubado com fosfatase alcalina (AP) -conjugated anticorpo secundário (IgG de coelho anti-cabra, Dako) diluída a 1: 1500 em Tween 20 /TBS durante 2 h. anticorpo ligado foi visualizado com AP substrato (Bio-Rad) após o desenvolvimento de reatividade para proteínas de anticorpo controle. A análise estatística
Todos os dados foram analisados por t pareado
-test (média ± SD, dois atados , 95% intervalo IC) a partir de pelo menos três experiências consecutivas para em tempo real de RT-PCR e ELISA. Para a quantificação de western blot, a análise densitométrica foi efectuada sobre a intensidade do nível de cinzentos das bandas de alvo em relação ao controlo bandas de? -actina Derivados de filmes digitalizados, processados utilizando uma imagem de software de análise Gene Ferramenta (GeneToos, versão 4.02; Syngene, Cambridge, Reino Unido) [33]. P Art & lt; 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Resultados
inflammasome (NLRP3, ASC e caspase-1) expressão em resposta a P. gingivalis
, P. gingivalis
LPS e ATP além de P. gingivalis
/P. gingivalis
LPS
Em todas as experiências, não houve diferenças significativas na expressão de genes entre os grupos de controlo não estimuladas e grupos de controlo de pré-tratadas com ATP.
Como mostrado na Fig. 1a, houve diminuição da regulação da expressão do gene após NLRP3 P. gingivalis
infecção às 2 e 4 horas, quando comparada com o grupo de controlo. Em contraste, houve um aumento da expressão do gene de NLRP3 em 2 h com P. gingivalis
estimulação com LPS. Além disso, NLRP3 foi significativamente regulada para cima após a pré-incubação com ATP durante 3 h, em seguida, a infecção com P. gingivalis
e estimulação com LPS de P. gingivalis
durante 2 h, mas foi regulada para baixo em 4 h. Ao nível da proteína (Fig. 2), enquanto que as células foram incubadas durante 2 4 h e com P. gingivalis e P. gingivalis
estimulação com LPS ou pré-tratamento com ATP durante 3 h, as tendências da proteólise de NLRP3 bandas correspondeu ao da expressão do gene. Isto indica que a activação de NLRP3 dependia P. gingivalis
LPS ou /e o ATP, mas não P. gingivalis
infecção. FIG. 1 expressão dos genes de NLRP3, ASC e caspase-1. Alterações significativas nos genes que codificam inflammasome NLRP3 (A), proteína do adaptador associado (ASC) (b), e caspase-1 (C) com diferentes tratamentos de P. gingivalis
infecção, P. gingivalis
LPS estímulos, e ATP mais P. gingivalis
ou P. gingivalis
LPS em células epiteliais H413. * P Art & lt; 0,05, ** P Art & lt; 0,01, emparelhado t
-test
Fig. 2 Western blot mostrando a expressão da proteína NLRP3 em células epiteliais H413 tratadas com condições diferentes (P. gingivalis
, P. gingivalis
LPS, e gingivalis ATP além de P.
ou P. gingivalis
LPS). As tendências das bandas NLRP3 medidos correspondeu a expressão do gene NLRP3. * P Art & lt; 0,05, emparelhado t
-test Online em Fig.1b, durante o curso do tempo de P. gingivalis
infecção, houve quedas significativas nos níveis de mRNA ASC (2 e 4 h) em comparação com o grupo controle, e aumentos significativos de níveis de mRNA ASC foram observados em 2 h estimulação com P. gingivalis
LPS. Para além de ATP P. gingivalis
infecção, havia-regulação de ASC em 2 h, seguido por diminuição da regulação em 4 horas, quando comparada com o grupo de pré-tratamento de ATP. Para além de ATP P. gingivalis
estimulação por LPS, houve uma acentuada redução de ASC em 4 horas, quando comparada com o grupo de pré-tratamento de ATP. Estes resultados sugerem que as alterações de ARNm ASC são críticos em P. gingivalis
LPS e ATP activação induzida NLRP3 inflamassoma. Ao nível da proteína, alterações semelhantes em proteína ASC foram medidos (dados não mostrados).
Além disso, como é evidente na Fig. 1C, os dados mostraram que não houve aumento na caspase-1, tanto a expressão do gene em P. gingivalis
infectado e P. gingivalis
grupos estimulados por LPS. Depois as células foram pré-incubadas com ATP durante 3 h, o nível de caspase-1 em ambas as P. gingivalis
infecção (2 h) e P. gingivalis
estimulação com LPS (2 e 4 h) grupos foi significativa para cima regulada em comparação com o grupo de pré-tratamento de ATP. Estes resultados indicam que a caspase-1 activação depende de estimulação de ATP em P. gingivalis
infectado ou P. gingivalis
LPS células tratadas. Não houve alterações no nível da proteína caspase-1 por imunotransf erências (dados não mostrados). Expressão de Il-1β em resposta a P. gingivalis
, P. gingivalis
LPS e ATP mais P. gingivalis
/P. gingivalis
LPS
Do mesmo modo, para determinar as alterações na expressão de IL-1β através da activação componentes inflammasome, a expressão do gene de IL-1β foi medido pelo tempo real de RT-PCR (Fig. 3a). Durante o curso de tempo de P. gingivalis
infecção, um aumento significativo no nível de ARNm de pró-IL-1β foi medida a 2 h, em comparação com o grupo de controlo, que, em seguida, diminuiu para o nível de controlo, a 4 h. O aumento nos níveis de ARNm de pró-IL-1 foram também observadas após as células pré-tratadas com ATP durante 3 h, em seguida infectados por P. gingivalis
de 2 e 4 h. Não houve alterações com células estimuladas com P. gingivalis
LPS e gingivalis ATP além de P.
LPS. Em sobrenadantes de cultura de células (Fig. 3b), houve uma elevada concentração de IL-1β madura em 2 h no grupo P. gingivalis
infecção, e em 3 e 4 h no ATP mais P. gingivalis
grupo infecção, o que correspondeu-se com a expressão de genes pró-IL-1β (Fig. 3a). Não havia secreção de IL-1β detectado nas P. gingivalis
grupo estimulação por LPS, mas um aumento notável atrasada em resposta a ATP mais P. gingivalis
grupo LPS em 5 h (Fig. 3b). Estes resultados indicaram que P. gingivalis
infecção tem uma maior capacidade para induzir a secreção de IL-1β de P. gingivalis
LPS. FIG. 3 a alterações nos níveis de pro-IL-1β de mRNA em células H413 tratadas com P. gingivalis
infecção e ATP pré-tratamento. b dados de ELISA demonstrando a proteína IL-1β madura libertado da H413 células após diferentes tratamentos. * P Art & lt; 0,05, ** P Art & lt; 0,01, emparelhado t
-teste de Il-18 expressão em resposta a em resposta a P. gingivalis
, P. gingivalis
LPS e ATP além de P. gingivalis
/P. gingivalis
LPS
A expressão do gene da IL-18 também foi medido pelo tempo real RT-PCR (Fig. 4a). Não houve alteração na pro-IL-18, medida nas P. gingivalis
grupo infecção, mas diminuiu significativamente Pro-IL-18 no grupo P. gingivalis
estímulos LPS a 2 h. Além disso, o pré-tratamento de células com ATP durante 3 h induziram a sobre-regulação de Pro-IL-18 em todos os pontos de tempo e aumentou significativamente a expressão de IL-18 em ambos os gingivalis
infecção por P. gingivalis e P.
LPS grupos estímulos. Em sobrenadantes de cultura de células (Fig. 4b), as células estimuladas com LPS de P. gingivalis
tiveram um aumento significativo na secreção de IL-18 maduro, que atingiu um pico entre 4 h e 5 h. Este não era evidente no P. gingivalis
grupo infecção. Este nível de proteína de alta não correspondia com a baixa pro-IL-18 nível de mRNA nas P. gingivalis
grupo LPS, possivelmente como concentração de proteína é afetada por vários parâmetros - principalmente síntese e clivagem [34]. Após as células foram pré-tratadas com ATP durante 3 h, a secreção de IL-18 madura em meios de cultura de células foi medida no ATP mais P. gingivalis
grupo infecção e demonstraram um aumento notável na concentração de citocinas. No entanto, nos gingivalis ATP além de P.
grupo LPS, uma curva bifásica foi mostrado, que não reflectia o nível de mRNA [34]. Estes resultados indicam que a P. gingivalis
infecção não induziu a secreção de IL-18 madura, enquanto que P. gingivalis
LPS ou estimulação ATP levou a uma madura produção de IL-18. FIG. 4 a alterações nos níveis de pro-IL-18 de mRNA em células H413 com diferentes tratamentos de P. gingivalis
LPS estímulos e gingivalis ATP além de P.
infecção ou P. gingivalis
LPS. b Os dados de ELISA mostrando IL-18 madura de proteína libertada a partir de células H413 após diferentes tratamentos. * P Art & lt; 0,05, ** P Art & lt; 0,01, t emparelhado
-test
Alterações no complexo inflamassoma NLRP3 após estimulação com P. gingivalis
, P. gingivalis
LPS e ATP
Figura 5 mostra um resumo da resposta imune inata contra P. gingivalis
infecção, e P. gingivalis
LPS e estimulação ATP neste modelo celular. Quando as células não são previamente tratadas com ATP (painel da esquerda), a infecção com P. gingivalis
neste modelo não desencadeia a activação do complexo inflamassoma NLRP3, incluindo NLRP3, ASC e caspase-1, até P. gingivalis
estimulação por LPS, embora num curto espaço de tempo de 2 h (excepto a caspase-1). Notavelmente, a produção de IL-1β não dependem da activação inflamassoma NLRP3 e está envolvido nos estágios iniciais de inflamação. IL-18 de produção requer tanto NLRP3 e ativação ASC após estimulação com P. gingivalis
LPS. Quando as células são previamente tratadas com ATP (painel da direita), uma resposta rápida da activação de NLRP3 inflamassoma foi mostrado (2 h), com subsequente produção das citocinas IL-1 beta e IL-18 em células com infecção por P. gingivalis
. No entanto, quando as células são estimuladas com LPS de P. gingivalis
, a produção de IL-1β necessária a caspase-1 e a activação mostraram um aumento de atraso na resposta ao tratamento com ATP (painel da direita). Os resultados indicam que a P. gingivalis
, P. gingivalis
LPS e ATP, todos têm diferentes efeitos sobre células epiteliais para produzir a resposta inflamatória final. FIG. 5 resposta imune inata a P. gingivalis
infecção ou P. gingivalis
LPS e estimulação ATP em células epiteliais. No painel da esquerda, quando as células são estimuladas com P. gingivalis
infecção ou P. gingivalis
LPS sem pré-tratamento de ATP, o complexo inflamassoma NLRP3 é inibida até P. gingivalis
estimulação por LPS, com excepção para a caspase-1 . a produção de IL-1β é não NLRP3 inflammasome dependente, no entanto, a secreção de IL-18 e baseia-se na activação NLRP3 ASC. No painel da direita, as células pré-tratadas com ATP, o qual activa NLRP3 inflamassoma, resulta na libertação subsequente das citocinas IL-1 e IL-18 em P. gingivalis
células infectadas. ATP também pode promover a activação de caspase-1 em cima de P. gingivalis
estimulação com LPS. A secreção de IL-1β é sempre consistente com a caspase-1 ativação após estimulação com P. gingivalis
Discussão LPS
Neste estudo, P. gingivalis
infecção sub-regula componentes inflammasome NLRP3, incluindo NLRP3 , ASC e caspase-1 em células epiteliais em todos os pontos de tempo, o que indica que P. gingivalis
tanto pode regular positivamente ou regular negativamente a expressão NLRP3, dependendo do tipo de células [35]. Neste modelo, P. gingivalis
pode amortecer a extremidade respostas imunitárias inatas através da inibição da activação de NLRP3 inflamassoma e evadir vigilância hospedeiro, oferecendo uma vantagem de sobrevivência para todos os organismos co-habiting do biofilme [35]. Enquanto isso, regulada para cima a expressão do gene de IL-1β após P. gingivalis
infecção, demonstra que a IL-1β é uma citocina fundamental na defesa do hospedeiro contra a infecção por P. gingivalis
[5]. Além disso, IL-1β não é NLRP3 ou caspase-1 dependente [5, 36] e outros fatores também podem influenciar a secreção de proteínas IL-1β. Portanto, especula-se que a secreção de IL-1β nas fases iniciais da infecção por P. gingivalis
desempenharia um papel muito importante na luta contra o agente patogénico invasor como parte da resposta imune inata [37]. Isto é consistente com a conclusão de que a IL-Dinarello 1β é uma das primeiras citoquinas para ser secretado durante as fases iniciais de inflamação e participa em quase todos os eventos envolvidos na activação e na regulação da inflamação [36]. Este tipo de activação IL-1β independente de inflammasome podem contribuir substancialmente para a inflamação dos tecidos [38].
No presente estudo, LPS desencadeia uma resposta imunológica marcante através de up-regulação da expressão gênica de NLRP3 e ASC, mas não caspase -1, o que indica que P. gingivalis
LPS seria um factor-chave para desencadear a resposta inflamatória que conduz ao estado de doença [16] e é considerada um factor de virulência importante na patogénese da doença periodontal. No entanto, a pesquisa de Jain e Darveau elucidou que a ativação de NLRP3 e ASC após estímulos pró-inflamatórias, tais como LPS podem estar envolvidos na apoptose de células hospedeiras, que apoia a ideia de P. gingivalis
morte celular induzida [39], que então facilitar periodonto-patógenos de invadir e destruir tecidos epiteliais. Além disso, a caspase-1 é sintetizado como um zimogénio inactivo. Sua ativação é rigidamente regulada por inflammasomes e associada a uma forma rápida e lítica de morte celular conhecido como pyroptosis [40]. Isto poderia explicar o mecanismo que caspase-1 ativação é inibida após P. gingivalis
estimulação LPS até ser ativado com estímulos de ATP no presente estudo.
ATP é um sinal de socorro extracelular muito eficiente [41]. Como um dos primeiros activadores descritos para induzir a formação inflamassoma NLRP3, que é atribuído ao grupo de Damps endógenos, que vêm a partir de células moribundas [22]. Neste estudo, foi demonstrado que o ATP activa o inflamassoma NLRP3, subsequentemente libertando citocinas IL-1 e IL-β 18, mesmo que o efeito é muito transiente e a concentração pode não ser suficientemente elevada para manter o nível de activada inflamassoma NLRP3. Estes resultados suportam que o ATP extracelular, como um sinal de perigo, resulta na montagem de NLRP3 inflamassoma e secreção de citoquinas maduras em P. gingivalis
células infectados por [26]. Além disso, um denominador comum de ATP extracelular activação NLRP3 tem a capacidade de formar poros da membrana que induzem danos da integridade da membrana ou causar perturbação da concentração intracelular de iões de [22].
Além disso, após a estimulação com ATP e P. gingivalis
LPS, a redução da expressão do gene ASC pode servir como um mecanismo para desligar a inflamação, evitando assim as respostas imunitárias superzelosos [32]. Da mesma forma, a linha celular epitelial (H413) utilizada neste estudo tem a função de restringir a actividade e a secreção de IL-1β [42] para proteger a célula contra a destruição dos tecidos. Isto pode explicar a nossa descoberta mostra um aumento adiado de IL-1β em resposta ao ATP além de P. gingivalis
estimulação LPS.
Conclusões
Os resultados indicam que P. gingivalis
estimulação LPS induziu uma maior pró-inflamatória reação do que P. gingivalis
infecção, e esta ação se torna mais intensa após pré-tratamento da ATP. Estes resultados podem fornecer novos insights sobre alvos para estratégias terapêuticas para o tratamento de doenças inflamatórias, como a periodontite
abreviações
ASC:.
Apoptose associada a proteína pontinho-like
ATP:
trifosfato de adenosina
Damps:
Danger-padrões moleculares associados
NLRP3:
Nod receptor -como (NLR) da família, o domínio contendo-3 pyrin
PAMPs:
Pathogen-padrões moleculares associados
P . gingivalis
:
Porphyromonas gingivalis
P. gingivalis
LPS:.
lipopolissacarídeo de P. gingivalis
Declarações
Agradecimentos
Agradecemos ao professor Neil Hunter e Dr Ping Ye por sua técnica e laboratório suporta. Agradecemos também Dr Jinlong Gao e Dr Xiaoyan Zhou para a prestação de P. gingivalis
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