Abstract
Fundo
Uma série de doenças orais, incluindo a periodontite, derivam microbiana biofilmes e estão associados com o aumento da resistência antimicrobiana. Apesar do uso generalizado de colutórios ser utilizadas como medidas adjuvantes para controlar estes biofilmes, o seu uso prolongado não é recomendado devido a vários efeitos colaterais. Portanto, os agentes antimicrobianos alternativos de amplo espectro que minimizem esses efeitos são muito procurados. Carboidratos ácido fúlvico derivado (CHD-FA) é um ácido orgânico que já havia demonstrado ser microbicida contra Candida albicans
biofilmes, portanto, os objetivos deste estudo foram avaliar a atividade antibacteriana de CHD-FA contra biofilmes orais derivados e para investigar os efeitos biológicos adjuvantes.
Métodos
concentrações inibitórias mínimas foram avaliados para CHD-FA e clorexidina (CHX) contra uma gama de bactérias orais, utilizando testes de microdiluição padronizado para planctônicas e sésseis. microscopia eletrônica de varredura também foi utilizado para visualizar mudanças em biofilmes orais após o tratamento antimicrobiano. Citotoxicidade destes compostos foi avaliada contra células epiteliais bucais, eo efeito de CHD-FA em marcadores inflamatórios do hospedeiro foi avaliada medindo mRNA e expressão da proteína.
Resultados
CHD-FA foi altamente ativa contra todas as bactérias orais testados, incluindo Porphyromonas gingivalis
, com uma concentração inibitória mínima séssil de 0,5%. Esta concentração foi mostrado para matar biopelículas de multi-espécies em cerca de 90%, níveis comparáveis aos de clorohexidina (CHX). Num modelo de cultura de células de mamífero, foi mostrado pré-tratamento de células epiteliais com tamponada DCC-FA para infra-regular significativamente principais mediadores inflamatórios, incluindo a interleucina-8 (IL-8), após a estimulação com um biofilme multi-espécies.
Conclusões
geral, DCC-FA foi demonstrado que possuem actividade antibacteriana de largo espectro, com uma função suplementar de ser capaz de regular negativamente a inflamação. Estas propriedades oferecem um espectro de atraente de função a partir de um composto derivado naturalmente, que poderia ser utilizada como uma estratégia alternativa para o tratamento tópico de doenças orais biofilme. Outros estudos in vitro e in vivo
são necessários para determinar o mecanismo preciso pelo qual CHD-FA modula a resposta imune do hospedeiro.
Material suplementar Palavras-chave
ácido Fulvic clorexidina biofilme antibacteriano Periodontite Inflamação eletrônico
a versão online deste artigo (doi:. 10 1186 /1472-6831-13-47). contém material suplementar, que está disponível para usuários autorizados
Fundo
cárie dentária, gengivite e periodontite são o maior parte das doenças microbianas comuns da cavidade oral, com a maioria associada com um biofilme polimicrobiana [1, 2]. Os biofilmes são um grupo de microrganismos multicelulares ligados um ao outro ou em cima de uma superfície, e são incorporados por uma camada protectora de matriz extracelular (ECM) [3]. Os biofilmes são de maior importância clínica do que suas contrapartes planctônicos livre flutuação devido à sua capacidade inata de resistir antimicrobianos de terapia e de acolhimento defesas. Isto é devido ao grande produção de ECM e de outros factores, tais como o aumento da extrusão de antimicrobianos através de actividade da bomba de efluxo reforçada [3, 4].
Bochechos antimicrobianos são uma das principais estratégias preventivas e terapêuticas actualmente utilizados na gestão de biofilme bucal doenças, dos quais clorexidina (CHX) é amplamente aceito como o "padrão ouro" [5]. Este agente anti-séptico tem uma actividade superior aos seus comparadores, e é tanto cidal e estático contra microorganismos presentes em biofilmes orais com papéis na patogênese da doença oral. Além disso, sua substantividade fornece atividade prolongada por sua capacidade de adsorver sobre a película encontrado na superfície do esmalte dos dentes [6]. Apesar disso, vários estudos têm mostrado o uso a longo prazo de CHX pode não ser prático, uma vez que está associada com a coloração dos dentes e sabor alterações [7, 8]. Além disso, têm sido descritos relatos recentes de eventos adversos, incluindo as reacções anafiláticas, a este composto [9]. Também foi recentemente mostrado ser ineficaz contra biofilmes cultivadas a partir de isolados clínicos [10].
A prevenção e tratamento de doenças biofilme orais, tais como as doenças periodontais e infecções das mucosas, podem beneficiar de um composto que tem a potência de CHX com efeitos colaterais mínimos, mas também provoca propriedades adjuvantes biológicos, tais como alteração de vias inflamatórias, que são claramente importantes na patogênese da doença de biofilme oral [11, 12]. Um estudo anterior demonstrou CHX é capaz de regular negativamente a mediadores inflamatórios, quando desafiado com uma estímulos bacterianas [13], embora aspectos toxicológicos de CHX pode ser a razão para a diminuição da expressão. Também mostrámos o benefício da utilização de agentes naturais no tratamento de infecções orais, onde o óleo da árvore do chá (TTO) não só era não-tóxico, mas foi capaz de atenuar a resposta imune do hospedeiro a um estímulo fúngica [14]. Além disso, o nosso grupo anteriormente avaliaram a atividade anti-séptica de ácido derivados de carboidrato fulvic (CHD-FA), onde foi demonstrado que o composto foi igualmente eficaz contra Candida albicans
células planctônicas e biofilme. Mecanicamente este foi identificado como um processo de ruptura da membrana que não foi impactado por mecanismos definidos biofilme adaptativos de resistência [15]. DCC-FA é um ácido orgânico coloidal, que é um dos principais constituintes dos ácidos húmicos. Uma forma purificada de DCC-FA foi recentemente produzida por um processo patenteado, que foi demonstrado ser não-tóxicos em um modelo de ferida de rato, com sugestões de actividade anti-inflamatória [16]. Além disso, uma recente, duplo-cego, randomizado controlado indicou que foi bem tolerado em um estudo clínico de eczema [17].
O objetivo deste estudo foi investigar se CHD-FA tem um amplo espectro de actividade contra biofilmes microbianos de relevância oral, para determinar se este poderia ser utilizado como uma alternativa para CHX colutórios base, que têm efeitos secundários conhecidos de uso prolongado. O objectivo secundário do estudo foi determinar se a concentração antibacteriana de CHD-FA tinha quaisquer propriedades imunomoduladoras adjuvantes, como relatado em outros lugares [16]. Nós relatamos que CHD-FA exibe actividade microbicida rápido contra biofilmes orais relevantes, e que também é capaz de regular negativamente a expressão de moléculas pró-inflamatórias em células epiteliais por via oral relevantes.
Métodos
Cultura condições e normalização
Uma selecção de estirpes laboratoriais de comensais e patogénicos bactérias associadas com a doença de biofilmes orais foram utilizados neste estudo, incluindo Porphyromonas gingivalis
ATCC 33277 e Fusobacterium nucleatum ATCC 10596
, os quais foram mantidos a 37 ° C em anaeróbio fastidioso agar (FAA [Lab M, Lancashire, Reino Unido]) em condições anaeróbias (85% N
2, 10% de CO 2 e 5% H 2, [Don Whitley Scientific Limited, Shipley, UK] ). Streptococcus mutans
10449, Streptococcus mitis
NCTC 12261, Aggregatibacter actinomycetemcomitans
OSM 1123 e Enterococcus faecalis
NCTC 5957 foram cultivadas e mantidas a 37 ° C na Colômbia ágar sangue (CBA [Oxoid, Hampshire, Reino Unido ] em 5% de CO 2. Todos os isolados foram armazenados indefinidamente em frascos Microbank® (Pro-Lab Diagnostics, Cheshire, Reino Unido) a -80 ° C.
P. gingivalis Comprar e F. nucleatum
foram propagadas em caldo anaeróbio 10 ml de Schaedler (Oxoid), S. mitis
e A. actinomycetemcomitans
foram cultivadas em 10 ml de Tryptic Soy broth (TSB [Sigma-Aldrich, Dorset, Reino Unido]) suplementado com 0,6% extracto de levedura e 0,8% de glucose. E. faecalis
foi crescida em TSB com glucose a 0,25%, e S. mutans
foi crescido em 10 ml de infusão de cérebro e coração (BHI [Sigma-Aldrich]), todas a 37 ° C e em condições atmosféricas adequadas. culturas nocturnas foram lavadas por centrifugação (1000 xg
) e ressuspensas em 10 ml de PBS. Todas as bactérias foram então normalizados e ajustadas a uma concentração final de trabalho de 5 × 10 4 e 1 × 10 7 células /ml para planctônicas e testes de susceptibilidade sessile, respectivamente.
testes de susceptibilidade antibacteriana de células planctônicas e biofilme
Durante o curso deste estudo dois compostos ativos do produtos de higiene bucal Dentracine (Fulhold Ltd, Cape Town, África do Sul) e Corsodyl (GlaxoSmithKline Consumer Health Care, UK) foram testados, ou seja, CHD-FA e CHX, respectivamente.
testes antimicrobiana para determinar as concentrações inibitórias mínimas (MICs) de células planctônicas (PMIC) foi realizada utilizando o método de microdiluição do CLSI M11-A8 para bactérias anaeróbicas [18] e CLSI M7-A9 para as bactérias cultivadas em 5% de CO 2 [19]. As concentrações bactericidas mínimas (CBM) também foram determinados por métodos de revestimento convencionais. Compra de testes biofilme padronizado P. gingivalis
, F. nucleatum, S. mitis Comprar e A. actinomycetemcomitans
foram cultivadas por 72 h e E. faecalis
durante 24 h em seus respectivos meios e condições atmosféricas, com a excepção de S. mutans
que foi cultivado em BHI suplementado com 2% de sacarose durante 48 horas. Os biofilmes foram cultivadas em estaticamente disponíveis comercialmente de 96 poços de microtitulação de fundo liso placas (Corning Incorporated, Nova Iorque, EUA) e teste de susceptibilidade séssil foi realizada como descrito noutro local [20]. A seguir ao tratamento antimicrobiano, biofilmes foram lavadas duas vezes com PBS e 10% alamarBlue® (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) foi adicionado aos biofilmes antes da incubação durante 4 horas no escuro [21]. As concentrações inibitórias mínimas sésseis (SMIC) foram lidos visualmente e sem alteração da coloração foi definida como a SMIC. Teste de todos os isolados planctônicas e sésseis foi realizada em quadruplicado em duas ocasiões distintas.
Testes de susceptibilidade antibacteriana de um multi-espécies biofilme periodontal
Um modelo de biofilme periodontal multi-espécies que consiste em P. gingivalis
, F. nucleatum, S. mitis Comprar e A. actinomycetemcomitans
foi desenvolvido para testes antimicrobiana. Todas as espécies bacterianas foram estandardizadas a uma × 10 7 ufc /mL em saliva artificial (AS) como anteriormente descrito [22]. Este era composto de mucinas de estômago porcino (0,25% w /v), cloreto de sódio (0.35 w /v), cloreto de potássio (0,02 w /v), cloreto de cálcio dihidratado (0,02 w /v), extracto de levedura (0,2 w /v ), laboratório lemco em pó (0,1 w /v), peptona proteose (0,5 w /v) em DDH 2O. A ureia foi diluída em PBS (40% w /v) e adicionado a uma concentração final de 0,05% (v /v) em AS. Os biofilmes foram preparadas em placas de 24 poços (Corning, Nova Iorque, EUA) contendo lamelas Thermanox ™ personalizadas (13 mm de diâmetro, Fisher Scientific). Para a adição de cada uma das espécies de bactérias para o biofilme uma suspensão bacteriana padronizado foi preparado através de 500 mL de EA. Inicialmente, S. mitis
biofilmes foram cultivadas durante 24 h. O meio foi então removido e padronizada F. nucleatum
adicionado, o qual foi incubado anaerobicamente durante mais 24 h. O sobrenadante foi novamente removido e P. gingivalis padronizados
e A. actinomycetemcomitans em
como adicionado ao biofilme. Este foi, em seguida, incubadas a 37 ° C numa câmara de anaerobiose durante mais 4 dias; cada dia sobrenadantes foram substituídos por AS fresco. Como DCC-FA mostrou-se activo a 0,5% v /v de encontro a todos os biofilmes bacterianas testadas neste estudo, esta concentração foi usada em adição a 0,2% v /v CHX para tratar multispecies biofilmes durante 30 min, antes cuidadosamente lavadas com PBS , e a viabilidade do biofilme determinada utilizando alamarBlue®. A absorvância foi lida a 570 nm e o comprimento de onda referência a 600 nm. A percentagem de redução na viabilidade do biofilme foi calculada de acordo com as instruções do fabricante. Este estudo foi realizado em três ocasiões diferentes, em triplicado.
A seguir ao tratamento antimicrobiano, os filmes foram mantidas e usadas para quantificar o número de cada uma das espécies de bactérias encontradas após DCC-FA e tratamento CHX em comparação com o controlo não tratado. Resumidamente, os biofilmes foram sonicadas em 1 ml de PBS durante 10 min e o ADN extraído utilizando o MasterPure Gram positiva ADN Purificiation Kit (Epicentre®, Cambridge, RU), seguindo as instruções do fabricante. 1 mL de DNA extraído foi adicionado a uma mastermix contendo 12,5 mL SYBR® Greener ™, 9,5-tratada UV ul-RNase livre de água e 1 mL de 10 mM iniciadores de avanço /recuo para cada espécie bacteriana. Os iniciadores utilizados foram os seguintes: A. actinomycetemcomitans
F - 5'GAACCTTACCTACTCTTGACATCCGAA3 ', A. actinomycetemcomitans
R - 5'TGCAGCACCTGTCTCAAAGC3', F. nucleatum
F - 5'GGATTTATTGGGCGTAAAGC3 ', F . nucleatum
R - 5'GGCATTCCTACAAATATCTACGAA3 ', P. gingivalis
F - 5'GCGCTCAACGTTCAGCC3', P. gingivalis
R - 5'CACGAATTCGCCTGC3 ', S. mitis
F - 5'GATACATAGCCGACCTGAG3' , S. mitis
R -. 5'CCATTGCCGAAGATTCC3 '
três réplicas independentes de cada parâmetro foram analisadas em triplicado usando a máquina MxProP PCR quantitativa e MxProP 3000 software (Stratagene, Amsterdam, Holanda). As amostras foram quantificadas com base em uma curva padrão previamente estabelecido composta de contagens bacterianas conhecidas.
Alterações ultra-estruturais de biofilme bacteriano
microscopia eletrônica de varredura (SEM) foi realizada em S. mutans
, E. faecalis
e os multiespecíficas biofilmes. As células foram normalizados em meios apropriados, conforme descrito acima, e cultivadas em lamelas directamente Thermanox ™ (Nunc, Roskilde, Dinamarca) para permitir a formação de biofilme. Seguintes biofilmes de maturação foram cuidadosamente lavados com PBS antes de seus respectivos tratamentos. Os biofilmes foram então cuidadosamente lavadas duas vezes com PBS e em seguida fixadas em 2% de para-formaldeído, 2% de glutaraldeído e 0,15 M de cacodilato de sódio, e 0,15% w /v de azul Alcian, pH 7,4, e preparado para SEM como descrito anteriormente [23]. Os espécimes foram sputter-revestido com ouro e visto sob um microscópio eletrônico de varredura JEOL JSM-6400. As imagens foram montados usando software Photoshop (Adobe, San Jose, CA, EUA).
Toxicidade de CHD-FA em cima de uma linha de células epiteliais orais
OKF6 /TERT2 células (oferecida pelo laboratório Rheinwald, Brigham e do Hospital da Mulher, Boston, EUA), uma linha celular de queratinócitos oral humana imortalizada, foram usadas para determinar a citotoxicidade do DCC-FA. As células foram cultivadas até 90% de confluência em queratinócitos meio isento de soro (KSFM) a 37 ° C em 5% de CO 2 e semeadas a uma densidade de 1 × 10 5 células /ml numa placa de 24 poços. Uma vez que as células atingiram 80-90% de confluência, as células foram cuidadosamente lavadas com PBS antes do tratamento com 0,5% (v /v) de DCC-FA ao pH 2,0 nativa e um pH neutro de 7,0 e 0,2% (v /v) CHX durante 30 min. Após 30 min, os compostos foram removidos e as células cuidadosamente lavadas com PBS para remover quaisquer agentes activos residuais. As células foram incubadas em KSFM durante 4 e 24 h antes da viabilidade celular foi avaliada utilizando o ensaio de alamarBlue®, como descrito acima. estudos de viabilidade foram realizadas em triplicata, em três ocasiões separadas.
Avaliando propriedades imunomoduladoras de CHD-FA células
OKF6 /TERT2 foram cultivadas a 90% de confluência em placas de 24 poços em definido pelo KSFM então pré-tratados com 0,5 % de CHD-FA (pH 7,0) durante 30 min. DCC-FA a pH 2,0 era tóxica contra a linha de células utilizada neste estudo e, portanto, não pode permitir-nos para analisar eventuais propriedades imunomoduladoras deste composto. Portanto, a CHD-FA tamponado a pH 7,0 foi utilizada para avaliar quaisquer outras propriedades biológicas do composto. 0,5% de CHD-FA a pH 2,0 e 0,2% de CHX demonstraram ser tóxicas para as células epiteliais, portanto, não foram adicionalmente investigadas. As células foram lavadas com PBS para remover DCC residual-FA. Como um agonista inflamatória foram utilizados os multiespécie biofilme periodontal, como descrito acima, o qual foi fixado ao lado inferior de uma inserção de cultura de células em suspensão (Millipore, Massachusetts, EUA) utilizando a vaselina, em seguida, colocado adjacente à monocamada de células. As células foram incubadas com o biofilme periodontal durante 4 e 24 h a 37 ° C em 5% de CO 2. As células não pré-tratados com CHD-FA, ou não desafiados com biofilmes, serviram como controles apropriados. Após a estimulação, os sobrenadantes e lisados celulares foram retidos para avaliar a regulação de um painel de mediadores pró-inflamatórios.
Análise da expressão do gene inicial foi levada a cabo usando um projetado RT Matriz 2 Profiler PCR (Qiagen, Crawley, Reino Unido ). RT 2 matrizes Profiler são uma base SYBR® Greener ™ PCR em tempo real, que permitem a detecção de vários genes de interesse, simultaneamente. Resumidamente, 24 uL de uma mastermix contendo SYBR® Greener ™, o ADNc sintetizado utilizando a RT 2 First Strand Kit (Qiagen) e água isenta de RNase foi adicionado a cada poço da 2 Profiler placa RT, que já continha os iniciadores directo e inverso, para os genes de interesse (IL-1 a, IL-1, IL-6, TNF, QCA 2, CSF3, IL-8, CXCL1, CXCL3, CXCL5, CCL1 e GAPDH). Duas repetições de cada condição foram utilizados na RT 2 Profiler, que foi levada a cabo em duas ocasiões separadas.
IL-8, a expressão do gene foi analisada utilizando baseado SYBR® verde qPCR (Invitrogen), utilizando GAPDH como um arrumação gene. Os iniciadores utilizados foram as seguintes: IL-8 de F 5'CAGAGACAGCAGAGCACACAA3 ', IL-8 R 5'TTAGCACTCCTTGGCAAAAC3', F GAPDH 5'CAAGGCTGAGAACGGGAAG3 ', R GAPDH 5'GGTGGTGAAGACGCCAGT3'. Resumidamente, o ARN foi extraído a partir de lisados celulares (Qiagen, Crawley, Reino Unido) e 55 ng /uL do ADNc sintetizada utilizando a RT 2 primeira cadeia de cDNA kit de síntese (Qiagen, Crawley, Reino Unido), conforme instruções dos fabricantes. 1 ml de cDNA sintetizado foi adicionado a uma mastermix contendo 12,5 ul SYBR® Greener ™, água RNase tratados com UV 10,5 ul e 0,5 ul de frente primers /retrocesso. Três repetições independentes de cada parâmetro foram analisadas em duplicado usando a máquina MxProP PCR quantitativa e MxProP 3000 software (Stratagene, Amsterdam, Holanda) e expressão gênica normalizados para o gene GAPDH de limpeza de acordo com o -ΔΔCT
método 2 [24 ].
Interleucina 8 libertação (IL-8) em sobrenadantes de cultura de células foi avaliada por ELISA (Invitrogen, Paisley, Reino Unido), conforme as instruções do fabricante. Os resultados foram calculados usando um 4 parâmetros ajuste de curva, quantificando alterações colometric a 630 nm (BMG-Labtech, Ortenberg, Alemanha).
Análise estatística
produção Graph, distribuição de dados e análise estatística foi realizada utilizando GraphPad Prism (versão 4; La Jolla, CA, EUA). Depois de avaliar se os dados conformados com uma distribuição normal de antes e depois transforma os dados, One-way análise de variância (ANOVA) e testes t foram utilizados para investigar diferenças significativas entre os grupos independentes de dados que se aproximava a uma distribuição de Gauss. Uma correcção de Bonferroni foi aplicada para o valor de p para contabilizar as comparações múltiplas de dados. Os dados não-paramétricos foram analisados utilizando o teste de Mann-Whitney U
-teste para avaliar as diferenças entre os dois grupos de amostras independentes. Estudante testes t foram usados para medir diferenças estatísticas entre os valores Δ
Ct dos dois grupos independentes avaliadas em estudos de expressão gênica, embora os dados podem ser representados como porcentagem ou fold mudança nas figuras. A significância estatística foi alcançada se a P & lt; 0,05
.
Resultados
DCC-FA tem actividade antibacteriana rápida e de largo espectro
Corsodyl® (0,2% de CHX) e Dentracine (0,8% de CHD-FA) são formulações orais contendo os ingredientes activos CHX e CHD-FA, respectivamente. Ambos os agentes mostraram-se altamente activo contra todas as bactérias orais planctónica e séssil testadas (dados não mostrados). Os estudos descritos neste manuscrito centrou-se na CHX ingredientes activos e DCC-FA e ambos mostraram ser altamente eficaz na inibição e matando todos os isolados testados orais produzidas quer quando planktonically e como biofilmes (Tabela 1). PMICs para os isolados orais variou de 0,0625% a 0,25% de DC-AF e de & lt; 0,00039% a 0,00078% de CHX. O rácio /CIMP PMBC para CHD-FA e CHX foram ≤4, indicando ambos os compostos apresentaram atividade bactericida. Nenhuma das espécies bacterianas testadas foram notavelmente mais sensível ou resistente a qualquer um dos compostos. Ambos CHD-FA e CHX apresentou atividade contra biofilmes maduros, com SMIC de 0,5% para CHD-FA e de 0,003% para 0,025% para CHX. Curiosamente, embora CHX foi eficaz em concentrações mais baixas, a mudança de dobra CIMP para SMIC variou de apenas 2 a 8 para CHD-FA, ao passo que para este CHX variou de 2 a 64. Em geral, P. gingivalis
foi o mais susceptível organismo para as terapias antimicrobianas testadas, em particular para as células planctônicas. Além disso, todos biofilme bacteriano foram igualmente suscetíveis a CHD-FA com um SMIC de 0,5% .table perfil 1 Susceptibilidade de bactérias orais clinicamente relevantes para quatro agentes antimicrobianos
MIC (%)
CHD-FA
CHX
Organismo
CIMP
MBC
SMIC
Dobre alterar
CIMP
MBC
SMIC
Dobre mudança
(SMIC /CIMP)
(SMIC /CIMP)
A. a *
0.25
0.25
0.5
2
0.00078
0.00313
0.025
32
S. mitis
0.0625
0.125
0.5
8
0.00078
0.00156
0.0125
16
S. mutans
0.25
0.25
0.5
2
0.00039
0.00078
0.025
64
E. faecalis
0.125
0.25
0.5
4
0.00156
0.025
0.003
2
F. nucleatum
0.125
0.5
0.5
4
0.00039
0.00078
0.195
32
P. gingivalis
0.0625
0.5
0.5
8
≤0.00039
0.00078
0.0625
≥16
*UMA. . Actinobacillus
CHD-FA - (Fulhold Ltd, África do Sul), CHX -. (GlaxoSmithKline Consumer Health Care, UK)
Uma análise mais aprofundada do impacto da CHD-FA sobre a estrutura celular física foi avaliada por SEM para biofilmes representativos. tratamento de CHD-FA reduziu a quantidade total de S. mutans
ECM (Figura 1B) e também causado perturbação da membrana celular, como demonstrado pelo aparecimento perfurado de E. faecalis
(Figura 1D). Figura 1 CHD-FA reduz estrutura da membrana celular ECM e compromissos. S. mutans
(X2000) e E. faecalis
(X5000) biofilmes foram ou não tratados (A e C, respectivamente), ou tratados com 0,5% (v /v) de DCC-FA (B e D, respectivamente) por 24 h em lamelas Thermanox ™. Estes foram então processadas e visualizadas em um microscópio eletrônico de varredura JEOL JSM-6400 e imagens montadas utilizando o software Photoshop. Note-se a redução na matriz extracelular (B) e perturbação de membranas bacterianas celulares (D), indicados por setas em células sésseis.
CHD-FA é eficaz contra um multi-espécies biofilme periodontal
Dado que biofilmes da via oral cavidade são polimicrobianas na natureza, desenvolvemos um representante modelo multi-espécies simples e reprodutível de placa sub-gengival para testar CHD-FA (Figura 2A). A actividade antimicrobiana de DCC-FA a 1 x SMIC foi mostrado para reduzir significativamente a viabilidade das células para menos de 10% (p & lt; 0,0001), o que foi comparável à CHX, que também reduziu significativamente a viabilidade das células a 8% (p & lt; 0,0001). No entanto, o tratamento a seguir o número de cada uma das espécies dentro dos biofilmes foram quantificadas e não mostrou qualquer redução significativa na biomassa após tratamento de CHD CHX-FA ou, em comparação com o controlo não tratado (Figura 2B). Figura 2 CHD-FA mata e interrompe multi-espécies biofilmes periodontais. Multi-espécies biofilmes periodontais foram cultivadas em lamelas Thermanox ™ dentro de placas de 24 poços para um total de 5 dias, com AS media trocado a cada dia. Após o desenvolvimento de biofilmes, as células foram tratadas com 0,5% (v /v) de CHD-AF e 0,2% (v /v) CHX durante 24 h antes de ser lavada com PBS. A redução da actividade metabólica foi medida utilizando o ensaio alamarBlue® (A). Todas as amostras foram ensaiadas em triplicado, em três ocasiões separadas. Os dados representam média ± SD (*** p & lt; 0,0001). Os biofilmes foram retidos após o tratamento com CHD-FA ou CHX e DNA foi extraído para quantificação de cada espécie utilizando SYBR® Greener ™ com base qPCR (B). Os biofilmes também foram analisados por SEM em qualquer 2000x (C, E, G) e 5000X (D, F, H). Estes foram processados e visualizados em um microscópio eletrônico de varredura JEOL JSM-6400 e imagens montadas utilizando o software Photoshop. multispecies não tratados biofilmes foram comparados primeiro a baixa ampliação (C) para biofilmes tratados com 0,2% (v /v) de CHX (E) e 0,5% (v /v) de DCC-FA (L) durante 24 h e foi demonstrado que o biofilme tratamentos causou desagregação. Na maior ampliação os biofilmes tratada com 0,5% (v /v) de DCC-FA durante 24 h resultou numa ECM fibrosa, como é indicado pelas setas (H), em comparação com o controlo (D) e CHX (F).
análise SEM destas biofilmes foi, em seguida, realizado para avaliar qualquer efeito sobre a arquitectura do biofilme (Figura 2C-H). A baixa ampliação (X2000) e DCC tanto CHX-FA foram mostrados para interromper arquitectura biofilme (Figura 2E e G) quando comparado com o controlo não tratado (Figura 2C), tal como mostrado pelas áreas de biofilmes desagregados esparsas. Além disso, em grande aumento (X5000) DCC-FA também apareceu para alterar a aparência física geral da matriz do biofilme com maiores quantidades de ECM fibroso observados, como indicado pelas setas (Figura 2H), em comparação com o controlo e CHX (Figura 2D e F).
CHD-FA altera a expressão de mediadores pró-inflamatórios
toxicidade CHD-FA foi avaliada utilizando uma linha de células epiteliais por via oral relevante para determinar se existiam quaisquer efeitos prejudiciais dos compostos testados antes de investigações imunomoduladores. Ambos CHX e DCC-FA, no seu pH natural de 2,0, mostraram ser altamente tóxicos em relação às células epiteliais, reduzindo a viabilidade para menos de 10% após 30 min de exposição (Figura 3). No entanto, quando DCC-FA foi tamponada a um pH neutro de 7,0, não foi observada nenhuma diminuição significativa da viabilidade celular. Figura 3 DCC-FA é não-tóxica contra uma linha de células epiteliais por via oral. Uma linha de células epiteliais por via oral relevante (OKF6 /TERT2) foi cultivada a 90% de confluência em placas de 24 poços para ensaios de toxicidade. As células foram tratadas com 0,5% (v /v) de DCC-FA a pH 2,0 e 7,0 e com 0,2% de CHX durante 30 min. Após o tratamento, as células foram cuidadosamente lavadas com PBS e a viabilidade celular avaliada utilizando o ensaio de alamarBlue®, com absorvância foi lida a 570 e 600 nm. Todas as amostras foram ensaiadas em triplicado, em três ocasiões independentes. Os dados representam média ± SD (*** p & lt; 0,0001).
Próxima estabelecidos para determinar se deve ou não DCC-FA foi capaz de induzir uma resposta biológica das células epiteliais, principalmente por medição das alterações da mediadores imunitários. Para avaliar isto, um modelo de quatro espécies de biofilme foi desenvolvido, em que não se observaram problemas de toxicidade quando em contacto com a linha celular epitelial em 4 h (dados não mostrados). Além disso, mostrámos que as células tratadas DCC-FA não alteram de forma significativa a libertação de IL-8, após 4 h e 24 h (dados não mostrados). estudos de expressão de genes iniciais utilizando a RT 2 Profiler em células epiteliais pré-tratada com DCC-FA antes do desafio com biofilme mostrou uma diminuição da regulação geral de mediadores pró-inflamatórias (Figura 4A). genes regulados negativamente significativos incluídos IL-6 (8,5 vezes [p = 0,018]), IL-1β (7,05 vezes [p = 0,012]), TNFa (5,22 vezes [p = 0,013]) e IL-8 (4,24 vezes [ ,,,0],p = 0,021]). Figura 4 DCC-FA modula principais mediadores inflamatórios in vitro. Uma linha de células epiteliais por via oral (OKF6) foi cultivada a 90% de confluência em placas de 24 poços para avaliar o efeito de DCC-FA na resposta imune do hospedeiro. As células foram pré-tratados com 0,5% (v /v) de DCC-FA pH 7,0 durante 30 min, lavadas com PBS e foram estimuladas com o multi-espécies biofilme periodontal durante 4 e 24 h. controlos não tratados também foram incluídos. As amostras foram ensaiadas em triplicado e em três ocasiões separadas. O ARN foi extraído a partir dos lisados celulares de 4 h, o ADNc sintetizado e utilizado na RT2 Profiler para analisar a expressão de um painel de mediadores pró-inflamatórios (A). As amostras em duplicado a partir de duas experiências independentes foram utilizados na RT2 Profiler. Os dados são representados pela média CI + 95%, em relação ao controlo não tratado. As amostras foram também ensaiadas para IL-8, a expressão de genes usando qPCR baseado SYBR® Greener ™ (B). Expressão de IL-8 está representada em relação ao gene de manutenção; GAPDH. Os sobrenadantes acumulados foram também usados para medir a libertação de IL-8 por ELISA proteína (C). Todas as amostras foram ensaiadas em triplicado, em três ocasiões independentes. Os dados representam média ± SD (* p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01)
A seguir, centrada na expressão de IL-8, um dos genes significativamente afectadas e um mediador chave da inflamação periodontal.. Ao nível do ARNm, IL-8 foi significativamente regulada negativamente em células pré-tratadas com DCC-FA após 4 h, quando comparados com o controlo não tratado (p = 0,0383) (Figura 4B). Não foi observada diferença estatisticamente significativa após 24 h de estimulação (p = 0,1712). Além disso, ao nível da proteína, a IL-8 de libertação foi demonstrado ser significativamente regulada negativamente quando as células foram pré-tratados com CC-FA, após 4 h (p = 0,008) e 24 h (p = 0,0037) a estimulação do biofilme ( A Figura 4C). . DCC-FA sozinho não teve efeito sobre células epiteliais orais IL-8 mRNA ou a expressão da proteína (dados não apresentados)
Discussão
doenças microbianas orais são tipicamente mediadas por biofilmes; comunidades de microorganismos que co-agregado como estruturas pegajosas e tenazes e que, caracteristicamente, têm maior resistência aos antimicrobianos [25]. Recentemente, relatou que colutórios, incluindo CHX foram ineficazes contra uma variedade de estirpes de MRSA clínicos [10], o que sugere que os agentes antimicrobianos devem ser investigados. Com efeito, estudos recentes em C. albicans
têm mostrado que a utilização de moléculas de origem natural são eficazes contra ambos os isolados por via oral e sistemicamente derivados [14, 15]. Aqui nós relatamos que CHD-FA, uma molécula anti-séptico de origem natural, exibe rápida atividade antimicrobiana de largo espectro, e também provoca atividade imunomoduladora.
Nós primeiro procedeu a uma avaliação comparativa das CHD-FA e CHX contra uma gama de bactérias importantes associados com infecções orais biofilme.
