dental da arte abstracta
Fundo
A cárie dentária é a doença microbiana mais comum que afeta a humanidade. métodos de avaliação de risco de cárie, identificação de biomarcadores e estratégias de desenvolvimento de vacinas estão sendo enfatizado para controlar a incidência da doença em grande parte evitáveis. receptores de reconhecimento de padrões, tais como os receptores do tipo toll (TLR) têm sido implicadas como moduladores das interacções hospedeiro-microbiana. Solúvel de TLR-2 e os seus co-receptores, CD14, identificada na saliva podem ligar-se os componentes da parede celular das bactérias cariogênicas e modular o processo da doença. O objetivo deste estudo é determinar o potencial de salivar sTLR-2 e sCD14 como biomarcadores da atividade de cárie e medidas indiretas da carga bacteriana cariogênica.
Métodos
não estimulados saliva total foi coletada de vinte livres de cárie e vinte cárie crianças ativas entre as idades de 5 e 13 anos. A concentração de sCD14 e sTLR-2 em conjunto com o da citocina IL-8 relatado para ser aumentada em cáries dentárias foi avaliada pelo ensaio de imunoabsorção enzimática.
Resultados
Embora o nível da sCD14 e que a de IL- 8 era equívoca entre os dois grupos, a concentração sTLR-2 em cáries saliva ativa foi significativamente maior do que no cárie saliva livre.
Conclusões of the sTLR-2 na saliva poderia servir como um biomarcador potencial para atividade de cárie.
Palavras-chave
pedágio Saliva Solúvel like receptor 2 cárie dentária material suplementar Biomarcador Electrónicas | A versão online deste artigo (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-108) contém material suplementar, que está disponível para usuários autorizados.
Fundo
a cárie dentária é uma doença infecciosa multifatorial causada por interações complexas entre as bactérias produtoras de ácido, carboidratos fermentáveis e factores do hospedeiro. Apesar de ser em grande parte evitáveis, permanece como a doença crônica mais prevalente em todo o mundo [1]. análises sistemáticas recentes sugerem que a incidência de cárie apresenta uma tendência crescente em crianças de 2-4 anos nos Estados Unidos [2]. Há evidência de aumento da prevalência em adultos no nível socioeconômico mais baixo em países europeus. Nas nações em desenvolvimento a prevalência está a aumentar tanto em crianças e adultos [3].
Detecção precoce de lesões branco-ponto, prendendo desmineralização e promover a remineralização são alguns dos métodos clínicos preventivos actualmente utilizados na gestão dental caries [4]. Além disso ênfase considerável é colocada no desenvolvimento de estratégias de avaliação de risco de cárie eficientes para determinar a probabilidade de um indivíduo desenvolver uma nova lesão de cárie e /ou para determinar o status do processo de cárie nas superfícies dos dentes individuais [4, 5]. Como a doença dos tecidos mineralizados dos dentes, a patogenia da cárie envolve desmineralização do esmalte por bactérias produtoras de ácido e destruição da substância orgânica resultante cavitação em [1, 4].
Saliva é reconhecido como uma fonte rica de factores do hospedeiro capazes de modular o processo de cárie [6, 7]. Os avanços tecnológicos têm ajudado na caracterização da proteômica salivares e peptidomics com a identificação de 1444 proteínas e peptídeos 11893, respectivamente [8]. Estas proteínas /péptidos pertencer a diferentes classes funcionais, tais como aqueles envolvidos em resposta a estímulos /stress, funções antioxidantes, reguladores e funções catalíticas da enzima [8, 9]. Vários componentes salivares foram avaliados por uma associação com a cárie dentária. Enquanto alguns exibem fraca associação, outros foram ambíguos entre normal e cárie saliva ativa [9-12]. Avaliação das glicoproteínas salivares com oligossacáridos específicas mostraram que os níveis mais elevados de seleccione oligossacárido que facilitam a colonização bacteriana na superfície dos dentes correlacionar com a incidência de cárie em adultos jovens [13]. níveis salivares de agentes antimicrobianos tais como defensinas alfa, statherin e cystatin S têm sido sugeridos como potenciais fatores de risco para o desenvolvimento de cárie [10, 14].
Toll like receptors (TLR) são germinal receptores que reconhecem padrões microbianos conservados normalmente codificados partilhada por grandes grupos de microrganismos. Atualmente 13 TLR de mamíferos e muitos dos seus ligandos são conhecidos [15]. Funcionando isoladamente ou em conjunto com co-receptores específicos no reconhecimento de padrões microbianos o ato TLRs como porteiros amostragem constante no meio ambiente e obter respostas para prevenir /controle de infecção [15, 16]. TLR-2 e TLR-4 têm sido mostrados para reconhecer o peptidoglicano de Gram positivo e o lipopolissacárido das bactérias Gram-negativas, respectivamente, quer isoladamente ou em associação com o co-receptor CD14 comum [17, 18]. Odontoblastos localizadas na superfície dentino-pulpar em dentes saudáveis foram mostrados para expressar TLR-2 e TLR-4. Dependendo da natureza da progressão da cárie resposta odontoblástica ou é suprimido com a formação da dentina reacional ou acelerada levando a inflamação pulpar [19, 20]. invasão microbiana da dentina foi mostrado para regular positivamente de TLR-4 em odontoblastos e medeiam a secreção de TGF-β facilitando a síntese de colagénio. Além disso TLR-4 de sinalização na odontoblastos também regular positivamente a metaloproteinase de matriz-2 promovendo a clivagem do sialophosphoprotein dentina (DSPP) a sialoproteína dentária (DSP), que forma um local de nucleação para a formação de cristais hydroxyapeptite no colagénio recém-formado [19]. Estimulação de odontoblastos como células com componentes da parede celular de bactérias Gram-positivas e de citoquinas induzida quimiocina secreções de um modo dependente de TLR-2 [20]. Os níveis elevados de citocinas IL-6, TNF-α e IL-8 foram observados em cárie saliva activa [21]. Enquanto
principalmente associada à membrana, recentemente determinadas formas solúveis de TLRs têm sido identificados em fluidos corporais. Tem sido sugerido que os TLR solúveis funcionam para sequestrar agentes patogénicos [22-25]. Recentemente, nós e outros têm relatado a presença de sCD14 solúvel e sTLR-2 na saliva [24, 26]. TLR-2 foi mostrado para reconhecer o peptidoglicano e o ácido lipotechoic de Streptococcus mutans
, as bactérias cariogênicas mais comuns [27]. Muitas evidências sugerem uma forte correlação entre o aumento da presença de bactérias cariogênicas no biofilme placa e números elevados das mesmas bactérias na saliva [6, 10]. Daí a hipótese de que o nível de sTLR-2 e sCD14 na saliva de cárie indivíduos ativos irá produzir uma medida indireta da carga bacteriana e agir como um biomarcador de atividade de cárie. Nossos dados sugerem que a sTLR-2 é maior na saliva total não estimulada (UWS) de crianças com lesões de cárie ativas.
Métodos
População do estudo
Neste prospectivo não randomizado estudo clínico quarenta crianças entre 6 e 12 anos de prestação de informações às clínicas pediátricas da Faculdade de Odontologia da Universidade de Indiana idade foram recrutados após a obtenção do consentimento informado dos pacientes e da guarda. O estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board da Universidade Indiana University Purdue, em Indianápolis. As amostras foram coletadas apenas de crianças sem doença oral ou sistêmica conhecida diferente de cárie dentária e sem dentes extraídos. exames orais de crianças foram realizadas e atividade de cárie gravado. Vinte crianças (13 meninos e 7 meninas) estavam livres de cárie e vinte crianças (12 meninos e 8 meninas) foram cárie ativa exibindo quatro a oito lesões de cárie que requerem restauração.
Recolha e tratamento
Todas as crianças foram instruídos a evitar Amostra comer e beber durante pelo menos 2 horas antes da recolha de saliva como descrito [24, 28]. Depois de enxaguar a boca brevemente com água, não estimulada saliva total (UWS) foi coletada de cada criança pelo método babando passiva por cinco minutos em tubos pré-refrigerados. As amostras foram transportadas em gelo para o laboratório para processamento imediato. Cada amostra foi clarificada por centrifugação a 4000 xg, a 4 ° C durante 10 min e armazenada em alíquotas a -80 ° C em CompleteTM Cocktail de Inibidor de Protease (Roche, Mannheim, Alemanha) até análise posterior.
Concentração de proteína total
o conteúdo de proteína total de amostras pré foi medida pelo método de Bradford que envolve a ligação do corante azul de Commassie para as proteínas [24, 25]. A forma de proteína-corante azul foi detectado a 595 nm usando espectrofotômetro (Gensys5 espectrofotômetro, corp Thermoelectronic, CA). A concentração da proteína em cada amostra foi determinada relativamente a uma curva padrão desenvolvido usando concentrações conhecidas de albumina de soro bovino
Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) Para determinar
CD14s na saliva um kit de ELISA de sanduíche (R & amp;.; D Systems , de Minneapolis, MN) foi utilizado de acordo com as recomendações do fabricante. anticorpo policlonal anti-TLR-2 humano (clone: Imgenex Corporation, San Diego, CA) foi utilizado para a detecção de TLR-2. Todas as amostras UWS foram esgotadas de amilase e imunoglobulinas por incubação em série com o anticorpo anti-humano amilase monoclonal (mAb) (1: 2500, catálogo # ab8944; Abcam, Cambridge, MA, EUA) e pérolas de proteína G (Miltenyi Biotec Inc. Auburn, CA ) a 4 ° C [24]. O teor de proteína das amostras previamente limpas foi determinada como acima e precleaned FDM a 1 ug /ml de concentração foi usada para medir a sCD14 e sTLR-2 níveis [25]. A pré-incubação do FDM com ambos os mAb anti-TLR2 (clone: 1030A5.138, Imgenex Corp, San Diego, CA, EUA) (0,5 ug /ml) ou com TLR-2 péptidos (1 ug /ml) foi realizado para avaliar a especificidade de ligação. Limite CD14 e TLR-2 foi detectada com peroxidase de rábano (HRP) conjugado de IgG anti-ratinho, seguido pelo substrato TMB (Pharmingen, San Diego, CA). A absorvância a 450 nm foi lida num leitor de microplacas (modelo 680: Biorad Laboratories, CA). A concentração de sTLR-2 ou sCD14 em pg /mL de proteínas salivares foi determinada utilizando uma curva padrão de recombinante humana purificada CD14Fc e TLR-2Fc (R & amp; D Systems) de concentração conhecida. IL-8 concentração nas amostras de saliva clarificada foram medidos utilizando um kit BD OptEIA3 ™ ELISA.
Análise Estatística As diferenças na
a concentração de IL-8, CD14 e TLR-2 entre os livres de cárie e cárie foram determinados grupos activos pelo teste t de Estudantes. valor de p inferior a 0,05 foi considerado significativo.
Resultados e discussão
Apesar dos avanços nos métodos de detecção precoce e medidas preventivas eficientes cárie dentária permanece como uma doença crónica altamente prevalente em todo o mundo. O aumento da incidência entre crianças em países desenvolvidos constitui um problema de saúde preocupante [2, 3]. Os dados demográficos da população do estudo são apresentados na Tabela 1. A concentração de proteína total da saliva humana tem sido demonstrado que exibem grandes variações que variam de 0,4 mg /ml a 7,1 mg /ml [29, 30]. Em nossa coorte de estudo a concentração de proteína total medido 6,24 +/- 1,98 mg /ml em cáries saliva livre e 5,92 +/- 2,37 mg /ml de cárie ativa saliva (Figura 1A) .table 1 Os dados demográficos da população estudada
dados clínicos
Número recrutados
Idade (anos)
Masculino
Feminino
cáries dentárias
12
8
8,76 +/- 3,42
controle
saudável
13
7
7,77 +/- 2,7
Figura 1 concentração total de proteínas na saliva: Esclarecido toda saliva foi avaliada por (a) conteúdo de proteína total por espectrofotometria e (B ) concentração de IL-8 por ELISA. Não foi observada diferença significativa entre os livres de cárie e cárie grupos de saliva ativos.
Para o número crescente de proteínas salivares são adicionadas as formas solúveis de receptores de reconhecimento padrão, o sTLR-2, sCD14 e sTLR-4 [25, 26 , 31]. A concentração de sTLR-2 na saliva parótida foi relatado para várias dobras ser mais elevada do que na saliva toda [31]. A fonte de sTLR-2 pode ser ou activa secreção a partir da glândula e /ou em resultado de clivagem extracelular do receptor ligado à membrana. Observou-se que a concentração de sTLR-2 em cárie saliva activa (29.5 +/- 3 pg /ml) foi significativamente mais elevada do que na saliva cárie livre (24,8 +/- 0,6 pg /ml) (Figura 2B). A sinalização através de TLRs em células hospedeiras induz a secreção de citocinas [15]. Anteriormente Gornowicz et al., Relataram níveis elevados de salivar IL-8 em cárie dentária [21]. Observamos que a salivar concentração de IL-8 não diferiram significativamente entre livres de cárie e cárie saliva ativa (Figura 1B). A observação variável entre os dois estudos poderiam ser atribuídas a diferenças na idade e da natureza da amostra (amilase e Ig não empobrecido empobrecido vs). A concentração de sCD14 na saliva era equívoca em ambos os grupos; variando entre 509 pg /ml e 1443 pg /ml no grupo de cárie e livre entre 609 pg /ml e 1829 pg /mL no grupo de cárie activa (Figura 2A). Anteriormente Bergandi et al., Relataram ausência completa de CD14s na saliva em crianças com dois a oito lesões de cárie [28]. O uso de saliva pré-limpeza eo método utilizado para medir sCD14 (Western blot contra sanduíche ELISA) poderia atribuir para as diferenças observadas entre o relatório Bergandi e nosso estudo. Figura 2 sCD14 e concentração sTLR-2 na saliva: saliva clarificada foi empobrecido da elevado peso molecular, proteínas abundantes, amilase e imunoglobulinas, tal como descrito na secção de métodos para aumentar a sensibilidade de detecção de menos abundante sCD14 e sTLR-2. O nível de (A) e sCD14 (B) sTLR-2 foi determinada por ELISA. * Representa p & lt; 0,05.
Com base na sua forte associação com a incidência de cárie vários estudos avaliaram os níveis salivares de S. mutans Compra de predição de risco de cárie com resultados variáveis [1, 32]. A etiologia polimicrobiana das cáries dentárias, bem como a interacção entre proteínas salivares e S. mutans
poderiam contribuir para a variabilidade [30, 33]. Quatro tipos principais de interacção proteína-salivar micróbio ter sido observado in vitro. Estes incluem a agregação, a adesão, a inibição /célula-morte, e nutrição [33]. Postula-se que o aumento observado na sTLR-2 em cárie saliva activo pode representar uma medida hospedeiro para combater o aumento de Gram + ve bactérias cariogênicas. Isto sugere que o nível salivar sTLR-2 pode representar um biomarcador eficiente para a actividade de cárie. A grande variação na concentração sTLR-2 em cárie saliva activo pode ser devido à extensão da cárie.
Conclusões A cárie dentária é uma doença complexa, a severidade clínica de que depende da interacção entre os micróbios orais, disponibilidade de carboidratos fermentáveis e factores do hospedeiro na saliva. Isto torna a identificação de fatores de risco preditivos para o processo de cárie muito difícil [5, 6]. Neste relatório, observou-se que duas proteínas solúveis, sCD14 e sTLR-2, que atuam na interface hospedeiro microbiano são modificados de cárie saliva activa com uma tarde que representa um potencial biomarcador para a atividade de cárie. Estudos futuros irá correlacionar os sTLR-2 níveis com as contagens de bactérias cariogênicas na saliva
abreviações
UWS:.
saliva total não estimulados
TLR:
Toll like receptor.
declarações
Reconhecimento
os autores agradecem o apoio prestado aos Alyssa Zhao pela Indiana CTSI para completar o programa de pesquisa de verão.
autores 'original submetido arquivos de imagens
Abaixo estão os links para os arquivos enviados originais dos autores para imagens. 'arquivo original para a figura 1 12903_2014_443_MOESM2_ESM.tif Autores' 12903_2014_443_MOESM1_ESM.tif Autores arquivo original para a figura 2 Conflito de interesses
Os autores declaram que não têm interesse competindo contribuições
dos autores
AZ:. Alyssa é um alto escola de segundo ano que realizaram os experimentos de ELISA como parte do programa de bolsas de pesquisa de verão, o Projeto Semente, co-patrocinada pela American Chemical Society e da Clínica Instituto Traduções Ciências Indiana. Ela também escreveu o primeiro rascunho da seção "Background". CB: Corinne é um assistente de pesquisa de graduação que ajudou Alyssa na condução das experiências de ELISA, ainda mais em análise de dados. Ela participou ativamente de processamento da amostra. Ela também participou na redação do manuscrito. JC: Dr. Chin é o odontopediatra e ajudou no recrutamento da população do estudo e coleta de amostras. MS: é o pesquisador sênior supervisionando o projeto, incluindo a obtenção de aprovações éticas, delineamento experimental e análise de dados e preparação do manuscrito. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.
