Abstract
Fundo
Durante um projeto de pesquisa sobre fungos Candida
espécies em pacientes usando obturador tratados com radioterapia para o carcinoma nasofaríngeo recorrente, que por acaso observada a presença de fungo preto em duas amostras consecutivas de um paciente. apresentação do caso
as amostras foram coletadas a partir de um 57 anos de idade cavalheiro Hong Kong que diagnosticou a ter tipo indiferenciado da nasofaringe carcinoma. Ele foi tratado com quimioradioterapia concomitante definitiva seguida de quimioterapia adjuvante e, em seguida, recebeu uma radioterapia segundo curso com IMRT. 18S rDNA revelaram que os isolados pertencem a Exophiala dermatitidis
que foi suscetíveis ao fluconazol, itraconazol, cetoconazol e voriconazol. Curiosamente, E. dermatitidis
isolados eram resistentes à caspofungina e um isolado foi resistente a anfotericina B. Ambos isolados biofilmes comparáveis ao de Candida albicans
formado. Um único isolado de E. dermatitidis
mostrou hemolisina e capacidade de proteinase comparável à C. albicans
enquanto que a outra não isolada.
foi Conclusão
nós, pela primeira vez, relataram a descoberta de um fungo preto -E. dermatitidis
isolados derivada de um paciente com carcinoma da nasofaringe tratados com radioterapia. Estes isolados mostraram-se resistentes à caspofungina, um importante agente antifúngico para a candidíase sistémica. Tão pouco se sabe sobre o fungo preto no cenário clínico, é importante que os médicos devem manter a par da nova descoberta neste campo.
Palavras-chave
preto fungo antifúngica susceptibilidade de biofilme virulência Chaminda Jayampath Seneviratne, Phoenix HL Fong e Victor HF Lee contribuíram igualmente para este trabalho.
Fundo
infecções fúngicas orais não são comuns em seres humanos normais e saudáveis. No entanto, micoses oportunistas podem ocorrer em indivíduos imunodeprimidos, por exemplo, pacientes com infecção pelo HIV e SIDA e doentes oncológicos em quimioterapia e /ou radioterapia [1,2]. A incidência de carcinoma da nasofaringe (NPC) é rara em muitas partes do mundo, mas é endêmica entre a Ásia, especialmente no sul da China, incluindo Hong Kong [3]. A radioterapia tem sido o tratamento padrão para o NPC em estágio inicial, enquanto a radioterapia combinada com quimioterapia é reservada para localmente e avançados doenças não-metastáticos regionais [4]. O principal adversário da saúde bucal de pacientes NPC é o efeito da radiação sobre as glândulas salivares, resultando em disfunção salivar, xerostomia e mucosite oral, que desempenhou um papel significativo na infecção da cavidade oral e contribuiu para Candida
infecção [5,6]. porções significativas das parótidas e cavidade oral inevitavelmente sofrem de dose elevada de radiação, devido à estreita proximidade destas estruturas para o tumor. Tem sido relatado que 50 - 80% dos pacientes desenvolveram xerostomia durante a terapia de radiação de intensidade modulada (IMRT), alcançando quase 100% quando a quimioterapia simultânea é dada [5]. A saliva desempenha um papel importante na homeostase oral, modulando a saúde da cavidade oral. imunoglobulinas salivares são importantes para a defesa oral que protegem os tecidos da mucosa contra infecção microbiana [7]. Por conseguinte, estes doentes são particularmente propensos a infecções fúngicas orais. Candida Comprar e Aspergillus Quais são as duas espécies de fungos oportunistas mais importantes [1]. doenças fúngicas causadas por outras espécies como Coccidiodes
, Histoplasma Quais são extremamente raros.
Exophiala dermatitidis
é um membro que pertence à ordem de fungos chaetothyriales, o que pode causar infecção em indivíduos saudáveis e imunocomprometidos [ ,,,0],8]. Chaetothyriales são os principais agentes causadores de feohifomicose humana e outros tipos de padrões clínicos como cromoblastomicose [8,9]. E. dermatitidis
foram encontrados em todo o mundo no ambiente humano-feita, por exemplo, as instalações balneares na Ásia e as instalações de banho turco públicas na Europa [10,11]. Provou-oligotrófica e termófilos, e é capaz de sobreviver em condições quentes e húmidas [8].
Deve notar-se que a E. dermatitidis
é considerado como um agente patogénico sistémica emergente no Sudeste Asiático [8]. infecções de fungos preto cerebrais e divulgados fatais foram relatados na China, e E. dermatitidis
foi um dos agentes causadores [12]. Anteriormente, E. dermatitidis
nunca foi relatado para ser isolado a partir da cavidade oral em seres humanos. Neste relato de caso, duas estirpes de E. dermatitidis
foram isolados de um obturador de um paciente com NPC durante IMRT. Nós abrangente realizada uma análise molecular dos isolados e caracterizados os seus comportamentos fenotípicas, em termos de susceptibilidade, hemolisina e proteinase produção antifúngico e formação de biofilme.
Caso apresentação
caso
A 57 anos de idade cavalheiro Hong Kong foi diagnosticado com tipo indiferenciado de carcinoma da nasofaringe (NPC) (fase III doença T2N2M0, 7ª edição AJCC) a Rainha Marry Hospital, Hong Kong, em março de 2008. Ele foi tratado com quimioradioterapia concomitante definitiva seguida de quimioterapia adjuvante concluída em setembro de 2008. Ele foi encontrado para ter recorrência local da NPC na cavidade nasal que se estende ao etmoidal direita e seio maxilar em agosto de 2012. ressecção craniofacial e maxilectomia direita foi realizada em outubro de 2012. relatório de patologia mostrou carcinoma indiferenciado recorrente. Um obturador oral foi feito sob medida para encher o defeito ferida e facilitação de mastigação, deglutição e dieta oral. Em vista da margem de ressecção positiva, foi sugerido chemoradiotherapy pós-operatório. Ele então recebeu um radioterapia segundo curso com IMRT com 60Gy entregue ao leito operatório e 56Gy para a região de alto risco, tudo em 30 fracções ao longo de 6 semanas de radioterapia acelerada simultânea (SMART) concorrente técnica com 2 ciclos de quimioterapia intravenosa com cisplatina 100 mg /m
2 a cada 3 semanas.
Materiais e métodos
amostras enxaguar a boca
Este paciente foi convidado para um estudo realizado no Departamento de Oncologia Clínica, Rainha Marry Hospital, da Universidade de Hong Kong , Hong Kong, tendo em vista a identificação dos atributos hospedeiras e organismos patogénicos de candidíase oral em pacientes com NPC tratados com IMRT. consentimento informado por escrito foi obtida a partir do paciente para participar no estudo. Aprovação para este estudo em conformidade com a Declaração de Helsínquia de conselho de revisão institucional local da Universidade de Hong Kong foi obtida antes de estudar início. O doente foi solicitada para enxaguar a boca com 10 ml de solução salina tamponada com fosfato (pH 7,3, 0,1 M) durante 1 min e expectoração para um recipiente estéril. As amostras foram, em seguida, transferido para o Laboratório Oral Biociências, Faculdade de Odontologia, Universidade de Hong Kong para análise microbiológica. Paciente foi orientado para expectorar saliva estimulada no início do estudo antes do início da IMRT e, em seguida, aos 2, 4, 6 e 8 semanas após o início da IMRT. lavar a boca amostras foram centrifugadas a 13.200 rpm, primeiro durante 10 minutos e o sedimento foi ressuspenso em PBS estéril seguida de vortex durante 30 segundos. Em seguida, as amostras foram plaqueadas a uma dextrose Sabouraud (SDA, Gibco). As placas foram incubadas durante 48 horas a 37 ° C.
Especiação do isolados fúngicos
O fungo foi subcultivada em SDA para obter colónias individuais, que foram depois submetidas a coloração de Gram e plaqueadas em CHORMagar de especiação. Em seguida, os isolados foram submetidos a comercialmente disponível API sistema de identificação 32C (BioMe'rieux, Marcy l'Etoile, França).
Molecular identificação
A fim de tornar a identificação precisa, o DNA das amostras de fungos negros foi extraído utilizando o MasterPure ™ kit de purificação de ADN de levedura (Epicentre Biotechnologies, Madison, Wisconsin, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. As amostras de DNA extraídas foram amplificados por PCR com iniciadores universais fungos específicos ITS3 e ITS4. O protocolo de amplificação por PCR consistiu em 30 ciclos de desnaturação durante 1 minuto a 94 ° C, recozimento durante 1 minuto a 50 ° C e extensão durante 2 minutos a 72 ° C. Amplicões foram verificados por electroforese em géis de agarose a coloração com brometo de etídio. Em seguida, amplicon foi purificado e submetido a 18S rDNA pelo Centre for Genome Research, The University of Hong Kong. sequência de ADN foi pesquisado contra o banco de dados do NCBI usando critérios padronizados para uma partida significativa.
testes de susceptibilidade antifúngica
A susceptibilidade antifúngica dos isolados foi avaliada utilizando o ensaio de difusão em disco após a CLSI M44-A diretriz com algumas modificações como temos previamente descrito [13,14]. Cinco agentes antifúngicos comercialmente disponíveis foram selecionados para este estudo: anfotericina B (ANF), caspofungina (CASP5), fluconazol (FLUCZ), cetoconazol (KTC), itraconazol (ITRAC), e voriconazol (VOR.1) (Neo-Sensitabs, Rosco Diagnostica, Taastrup, Dinamarca). Suspensões equivalentes a McFarland 0,5 turbidez da cultura pura estavam preparados. Vinte microlitros da suspensão foram inoculadas em agar de Mueller-Hinton por máquina chapeamento de espiral para alcançar uma inoculação uniforme perturbado. discos de voriconazol anfotericina B, caspofungina-5 ug, fluconazol 25 ug, itraconazol 10 ug, 15 ug cetoconazol e 1? g de dez microgramas foram então aplicadas para o agar inoculado. As placas foram incubadas aerobicamente a 37 ° C durante 2 dias. Em seguida, os diâmetros das zonas de inibição do crescimento foram medidos. O ensaio foi realizado em duplicado em duas ocasiões separadas.
A formação de biofilme avaliada por ensaio de redução de XTT
E. dermatitidis
biofilmes foram desenvolvidos de acordo com um protocolo publicado anteriormente em biofilmes de fungos [15,16]. Em resumo, a cultura de caldo de E. dermatitidis
foi preparada por inoculação de uma ansa de cultura em meio de base de azoto de levedura (YNB, Disco) suplementado com glucose 50 mM durante a incubação durante a noite a 37 ° C. A cultura foi lavado duas vezes com 20 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS; pH 7,2, 0,1 M) por centrifugação. A cultura lavada foi ressuspensa em meio YNB suplementado com glucose 100 mM e obtida uma suspensão igual a turbidez McFarland 4. Cem microlitros da suspensão foram adicionados a cada poço de uma placa de 96 poços de microtitulação de poliestireno estéril (Iwaki, Tóquio, Japão). Uma fila de poços contendo apenas o meio, sem qualquer suspensão de células foi preparada como controlo negativo. A placa foi incubada durante 1,5 horas a 37 ° C em um agitador a 75 rpm para permitir que as células a aderir à superfície do poço (fase de adesão). Em seguida, a suspensão de células em cada poço foi aspirado e lavado com 100 ml de PBS para remover as células não aderentes. Duzentos microlitros de meio YNB com glicose a 100 mM foi adicionado a cada um dos poços foram lavados, e a placa foi incubada a 37 ° C em um agitador a 75 rpm durante 48 horas. A formação de biofilme
foi avaliada usando um XTT ensaio de redução de [15,17]. Uma mistura de 40 ml de XTT (Sigma, St. Louis, MO) (1 mg /ml em PBS), 2 ml de menadiona (Sigma) (0,4 mM) e 158 ml de PBS foi preparado. Após a fase de crescimento de 48 horas, todas as suspensões de células foram aspiradas e lavadas com 200 ml de PBS durante 3 vezes. Duzentos microlitros de solução de PBS-XTT-menadiona foram adicionados a cada um dos poços foram lavados, e a placa foi incubada a 37 ° C no escuro durante 3 horas. A seguir à incubação, 100 ml de solução de cada cavidade foi transferida para um novo poço e medida com um leitor de placas de microtitulação (SpectraMAX 340 Tunable leitor de microplacas Molecular Devices Ltd., Sunnyvale, CA) a 490 nm, ensaio de hemolisina
<. br> actividade hemolítica foi determinada com o ensaio de placas de sangue como já anteriormente descrito para outras espécies fúngicas [18]. Em resumo, as suspensões com um tamanho de inóculo de 10 8 células /ml de cultura pura foram preparados. Dez microlitros da suspensão foram manchados em ágar Sabouraud de dextrose suplementado com glicose a 3% e 7% de sangue de ovelha fresco (p /v; Merck, Darmstadt, Alemanha). As placas foram incubadas a 37 ° C em 5% de CO 2 durante 48 horas. O halo translúcido distintiva em torno do local inoculo mostrou actividade hemolítica positiva, que foi medido usando o sistema de análise de imagem computorizado (Qwin, Leica, Reino Unido). A intensidade da produção de hemolisina pela espécie fúngica foi representada pelo índice hemolítica (Oi), a razão obtida dividindo-se o diâmetro da colónia por o diâmetro total da colónia e o halo translúcido. C. albicans
ATCC 90028 e C. parapsilosis
ATCC 22019 estirpes foram utilizados como controle positivo e negativo da atividade hemolítica respectivamente. O ensaio foi realizado em quadruplicado em duas ocasiões separadas.
Ensaio proteinase
ensaio de albumina de soro bovino (BSA) foi realizada para avaliar a actividade de proteinase como já descrito anteriormente [19]. Suspensões equivalentes a McFarland 2 turbidez da cultura pura estavam preparados. Dez microlitros da suspensão foram inoculadas com ponto de BSA a 1% (w /v) de placa de agar. As placas foram incubadas aerobicamente a 37 ° C durante 5 dias, seguido por coradas com negro de naftaleno solução 1,25% em metanol /água 90% v /v durante 15 minutos e descolorou-se durante mais 36 horas com a mudança da solução. O diâmetro da zona de proteólise e da colónia foram medidas usando o sistema de análise de imagem computorizado (Qwin, Leica, Reino Unido). produção de proteinase (Pr valor d) foi obtido dividindo o diâmetro da zona de proteólise e a colónia por o diâmetro da colónia. C. albicans
ATCC 90028 e C. parapsilosis
ATCC 22019 estirpes foram utilizados como controle positivo e negativo da actividade proteinase respectivamente. O ensaio foi realizado em quadruplicado em duas ocasiões distintas.
Resultados e discussão
Embora Exophiala Quais são fungos ambientais, a sua presença em amostras clínicas coletadas em duas visitas consecutivas, não deve ser desconsiderado como uma contaminação [20] . fungos negros são conhecidos há décadas, no entanto, eles estão entre os grupos fúngicas mais difíceis de identificar, e, portanto, a confusão de diagnóstico era comum no passado [8]. Devido ao avanço das técnicas de biologia molecular e da disponibilidade de sequências de ADN de loci de genes diferentes em bases de dados de sequências, tais como a GenBank, identificação de Exophiala
ao nível de espécie tem sido possível. Anteriormente, Hong Kong registrou um único caso de E. dermatitidis
associado com leucemia mielóide aguda 43 year-old paciente do sexo feminino submetidos a transplante de células estaminais do sangue periférico [20]. No entanto, foi isolado a partir de amostras de fezes.
Inicialmente, estávamos à procura de recuperar Candida
espécies a partir de amostras deste paciente. No entanto, observou-se o aparecimento de colônias escuras incomuns nas placas SDA. A escuridão da cor aumentou quando a cultura está a envelhecer e depois de alguns dias apareceu como um "fungo preto". A fim de se obter uma cultura pura, as colónias de fungos negros foram posteriormente sub-cultivadas em SDA para a segunda fase, que foram depois submetidas a coloração de Gram. Dois isolados de fungos negros foram encontrados em duas das amostras de lavagem bucal, respectivamente, eles foram nomeados como OM2 e OM4. OM2 e OM4 mostrou células Gram-positivas sob o microscópio de luz, 1000 × ampliação, cujo tamanho, forma e cor são semelhantes a C. albicans
com alguns elementos de hifas. Em seguida, nós banhado o isolado no CHORMagar ao lado de Candida albicans
e Candida parapsilosis
. isolados fúngicos mantido a sua cor preta em CHROMagar enquanto C. albicans
e C. parapsilosis
mostrou cor verde e branca clássica respectivamente (Figura 1). Nós também empregou clássica Candida
identificação API 32C método AUX que apresentou resultados negativos. Figura 1 Especiação de isolados por CHROMagar. cultura pura de C. parapsilosis
OM2 e foram riscados sobre a mesma placa CHROMagar (a). E cultura pura de C. albicans
e OM4 foram semeadas em outra placa CHROMagar (b). Ambos OM2 e OM4 mostrou cor castanho escuro na placa, que foram mantendo a sua cor escura. Em seguida, foram observadas as cores das culturas e as fotografias foram tiradas após 48 horas de incubação.
Referência aos resultados do ensaio de difusão em disco, ambos os isolados de fungos resistentes a preto eram caspofungina (Tabela 1). Além disso, é de salientar que OM2 isolado também foi resistente à anfotericina B, enquanto OM4 isolar com sensibilidade intermediária. A anfotericina B é considerado como o "padrão de ouro" para o tratamento de infecções fúngicas [21]. Portanto, estirpes de fungos que são a resistência à anfotericina B deve ser dada uma atenção especial. No entanto, ambos os isolados foram sensíveis à classe azole de antifúngicos viz.
Fluconazol, cetoconazol, itraconazol e voriconazol. dados de susceptibilidade antifúngica na clínica E. dermatitidis
isolados ainda são escassos, apesar dos avanços em métodos de ensaio. Em geral, Exophiala
espécies parecem suscetíveis a anfotericina B, triazol e terbinafina in vitro
. No entanto, a eficácia clínica de antifúngicos contra algumas cepas de Exophiala
permanece controversa como os pacientes tenham expirado, apesar da terapêutica antifúngica [22]. Por conseguinte, a correlação de resultados in vitro e in vivo em resposta devido à farmacocinética, factores do hospedeiro, o início da infecção e terapia continua a ser determinado. Um relato de caso mostrou E. dermatitidis
isolar que é resistente à equinocandina classe de drogas: a caspofungina, microfungin e anidulafungina, mas suscetível a azoles e anfotericina B [23]. Outro estudo de 43 isolados de E. dermatitidis
mostraram susceptibilidade à anfotericina B, voriconazol, itraconazol, 5-fluorocitosina e terbinafina. No entanto, este estudo demonstrou que a anfotericina B tem uma fraca actividade contra E. dermatitidis
[24]. Portanto, recomenda-se realizar o teste de suscetibilidade aos antifúngicos imediatamente quando E. dermatitidis
é suspeito como o patógeno em infections.Table humano 1 O resultado dos testes de susceptibilidade antifúngica de fungos negros avaliada por ensaio de difusão em disco
Amostra
Controle
preto fungos
C. albicans
C. parapsilosis
OM2
OM4
AMPH
ØMean
14,8
S
12,5
I
9,3
R
12,3
I
Faixa
13-16
12-13
9-10
12-13
CASP5
ØMean
15,5
S
18
S
NA
R
NA
R
Faixa
14-17
17-19
NA
NA
FLUCZ
ØMean
50,8
S
36,5
S
25,3
S
30
S
Faixa
50-52
35-38
25-26
29-31
KETOC
ØMean
53,5
S
52
S
56,3
S
59,7
S
Faixa
53-54
51-53
56-57
5,9-6
ITRAC
ØMean
22
S
18,5
S
25,7
S
26,3
S
Faixa
21-23
18-19
25-26
26-27
VOR. 1
ØMean
52,5
S
45,5
S
52,3
S
53,7
S
Faixa
51-54
44-47
52- 53
53-54
ØMean = zona de diâmetro em mm; AMPH - Anfotericina B (resistente: & lt; 10 mm; Intermediário: 10 mm - 14 mm; Suscetíveis: ≥15 mm), CASP5 - caspofungina (resistente: ≤12 mm; Intermediário: 13 mm - 15 mm; Suscetíveis: ≥16 mm ), FLUCZ - fluconazol (resistente: ≤14 mm; Intermediário: 15 mm - 18 mm; Suscetíveis: ≥19 mm), KTC - cetoconazol (resistente: ≤20 mm; intermédios: 21 mm - 27 mm; Suscetíveis: ≥28 mm ), ITRAC - Itraconazol (resistente: & lt; 13 mm; Intermediário: 14 mm - 22 mm; Suscetíveis: ≥23 mm), VOR. 1 - O voriconazol (resistente: ≤13 mm; Intermediário: 14 mm - 16 mm; Suscetíveis: ≥17 mm); R-resistentes, I-intermédia, S-sensíveis.
Os resultados do ensaio de redução de XTT mostraram que o negro fungos, OM2 e OM4 foram capazes de formar biofilme (Quadro 2, Figura 2). Assim, de acordo com a leitura de XTT, E. dermatitidis
formas biofilme comparável tão bom como C. albicans
SC5314. formação de biofilme é conhecido como um virulência importante atribuir diretamente associado com resultados adversos da Candida
infections.Table 2 O resultado do ensaio de redução de XTT ea atividade da hemolisina e proteinase de fungos preto
XTT
hemolisina
proteinase
Amostra
Abs média
Faixa
Hi média
Faixa
Pr d média
Faixa
Controle
C. albicans
1,92
1,73-2,09
1,73
1,43-2
1,94
1,83-2,07
C` parapsilosis
1,68
1,51-1,94
1,14
1,1-1,13
NA
NA
preto fungi
OM2
2.03
1.8-2.36
2.33
2.22-2.55
NA
NA
OM4
2.15
1,91-2,43
NA
NA
NA
NA
Abs = valor de absorção; Oi = índice hemolisina; valor Prd = índice de produção proteinase.
Figura 2 ensaio de redução de XTT de fungos negros após 3 horas de incubação. A escuridão de uma cor laranja representou a quantidade de biofilme. OM2 e OM4 mostrou uma cor laranja forte depois de 3 horas de incubação no ensaio de redução de XTT, que era tão forte como C. albicans
e mais forte do que C. parapsilosis
. A solução em cada poço foi medida por leitor de placa de microtitulação, e os valores de absorvência resultantes foram registados na Tabela 2.
É óbvio para ver a hemólise de agar de sangue de ovelha induzido por E. dermatitidis
OM2 isolado (Figura 3a ). Houve um halo translúcido distintiva em torno do local de inoculo que mostra a actividade hemolítica positiva. O índice hemolítica (Oi) foi tão elevada como a de C. albicans
. Pelo contrário, E. dermatitidis
OM4 isolado apresentou uma actividade hemolisina negativa (Figura 3b). Ele é um resultado inesperado como ambos os isolados foram recuperados a partir de um paciente, no mesmo local. O ferro tem um papel importante na sobrevivência de um agente patogénico invasor como C. albicans
no hospedeiro humano. Portanto, patógenos invasivos requerem enzimas hemolisina para extrair ferro indiretamente por lise proteínas que contêm ferro, como a hemoglobina. No entanto, as implicações clínicas exatas destes resultados continua a ser totalmente elucidado. A Figura 3 fotografias mostrando a hemólise de agar de sangue de carneiro induzido pelo fungos preto. Imagem a e b mostram a actividade de hemolisina e OM2 OM4 respectivamente. Dez microlitros de suspensão de cultura foram vistos na placa de agar de sangue de sono. A placa foi observada e o diâmetro do halo foi medida após 2 dias de incubação. Um halo translúcido distintiva em torno do local inoculo foi mostrado em A, que demonstrou actividade hemolítica positiva de OM2. Nenhum halo pode ser visto em b, e, portanto, OM4 foi considerado como nenhuma atividade hemolítica.
Conclusões
Para concluir, nós relataram o primeiro caso de isolamento de E. dermatitidis
espécies da cavidade oral humana. Além disso, também gerou dados pioneiros sobre os atributos de virulência, como a formação de biofilme, hemolisina e ensaio de proteinase. De nota, um destes E. dermatitidis
isolados foi resistente à caspofungina e anfotericina B, as duas melhores antifúngicos disponíveis no mercado para as infecções fúngicas sistémicas. Este achado justifica mais estudos clínicos sobre este patógeno emergente, particularmente entre o corpo crescente da população imunocomprometidos incluindo pacientes com NPC.
Consentimento
consentimento informado por escrito foi obtida a partir do paciente para a publicação deste relato de caso e qualquer acompanhamento imagens. Uma cópia da autorização escrita estava disponível para análise pelo Editor desta revista.
Notas
Chaminda Jayampath Seneviratne, Phoenix HL Fong e Victor HF Lee contribuíram igualmente para este trabalho.
Declarações
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo Fundo de Investigação para o Controle de Doenças Infecciosas, Alimentação e Serviços de Saúde, Hong Kong Governo da RAEM: 11100722.
interesses concorrentes
os autores declaram que não têm interesses conflitantes
. contribuições dos autores
CJS e VHFL concebido e desenhado o estudo. VHFL realizou a coleta de amostras. PHLF realizados os experimentos. CJS, PHLF, SSWW analisou os dados. CJS, PHLF, SSWW e VHFL escreveu o manuscrito. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.
