Resumo
fundo
óssea recombinante proteína morfogenética dois (rhBMP2) tem sido utilizada para uma variedade de aplicações clínicas em cirurgia ortopédica e procedimentos dentários. Apesar do seu uso generalizado, têm surgido preocupações quanto à sua curta semi-vida e bioactividade transiente in vivo. recente investigação destinada a desenvolver rhBMP2 sintetizado a partir de uma cadeia de polipeptídeo mais curto (108 aminoácidos) foi realizado.
Métodos
As propriedades osteopromotive de BMP-2 foram investigados sobre o comportamento celular. Cinco concentrações de rhBMP2_108 incluindo 10, 50, 100, 200 e 500 ng /ml foram comparados com um rhBMP2 disponível comercialmente (100 ng /ml). Cada uma das concentrações de trabalho de rhBMP2_108 foram investigados em osteoblastos MC3T3-E1 para a sua capacidade para induzir o recrutamento de osteoblastos, proliferação e diferenciação tal como determinado por fosfatase (ALP) coloração alcalinas, a coloração com vermelho de alizarina, e PCR em tempo real para os genes que codificam para ALP, osteocalcina (OCN), colagénio-1 (COL-1) e Runx2.
resultados Os resultados demonstram que todas as concentrações de rhBMP2_108 melhorou significativamente o recrutamento de células e proliferação de osteoblastos em 5 dias após sementeira. Além disso, rhBMP2_108 teve os efeitos mais pronunciados sobre a diferenciação dos osteoblastos. Verificou-se que tinha rhBMP2_108 ao longo de um aumento significativo de quatro vezes na actividade de ALP em sete e 14 dias após a inoculação e as concentrações que variam de 50 a 200 ng /ml demonstraram os efeitos mais pronunciados. Análise de PCR em tempo real para os genes que codificam ALP, OCN, COL-1 e Runx2 aumentos dependentes da dose ainda confirmada aos 14 dias pós-semeadura. Além disso, a coloração com vermelho de alizarina demonstraram um aumento dependente da concentração na coloração em 14 dias.
Conclusão Os resultados do presente estudo demonstram que esta cadeia polipeptídica mais curto de rhBMP2_108 é igualmente tão bioactivo como disponível comercialmente rhBMP2 para o recrutamento de células progenitoras células, facilitando a sua diferenciação para a linhagem dos osteoblastos. Futuro do estudo in vivo são necessários para investigar a sua bioactividade.
Palavras-chave
BMP2 Osteoindutora osteoindução Osteoblast diferenciação regeneração óssea guiada fundo
O uso de fatores de crescimento e biomateriais com propriedades de indução de osso tem desempenhado um papel fundamental no opções de tratamento para pacientes que sofrem de uma variedade de defeitos do osso causados por qualquer fractura ou doença [1-3]. Osteoporose, uma doença caracterizada por baixa densidade mineral e fragilidade posterior [4] já atingiu cerca de 200 milhões de pessoas em todo o mundo, com 80% sendo as mulheres na pós-menopausa [5-7]. O aumento significativo de doenças metabólicas do osso em combinação com lesões traumáticas causadas por acidentes de esportes, acidentes de viação e outras fraturas relacionadas necessita de agentes ósseos induzir capazes de acelerar a regeneração óssea, muitas vezes em situações comprometidas, tais como fraturas relacionadas com osteoporose [8-11].
Um factor de crescimento que tem sido amplamente utilizado com a aprovação da FDA é de que as proteínas morfogenéticas do osso (BMPs) [12-14]. BMPs foram inicialmente extraído a partir da matriz óssea desmineralizada e revelou-se que estas proteínas de baixo peso molecular demonstrou a capacidade para formar osso ectópico em locais extra-esquelético em animais [15, 16]. Desde então, BMPs foram capazes de regenerar a uma multiplicidade de defeitos ósseos e tem sido mostrado para melhorar o recrutamento celular, proliferação e diferenciação de células mesenquimatosas, e acelerar a sua diferenciação em direcção osteoblastos formadores de osso [17]. Apesar das vantagens clínicas de proteínas recombinantes, foram levantadas dúvidas a respeito de seus bioatividade transitória, instabilidade proteínas, taxas de dissolução rápida e meias vidas curtas [18]. Por estas razões, o uso de rhBMPs são tipicamente administrados em altas doses supra-fisiológica que carregam o risco de potenciais efeitos colaterais associados com a sua utilização [19]. Além disso, outros factores que podem levar a uma redução na bioactividade in vivo incluem o papel de antagonistas e a sua especificidade para diferentes BMPs (noggin, chordin, Dan), o papel do organismo hospedeiro para a expressão (E. coli vs CHO) ea diferenças associadas nos padrões de glicosilação que pode conduzir a diferenças na biodisponibilidade e estabilidade [20-22].
recentemente, o desenvolvimento de uma nova proteína recombinante fabricada a partir de uma cadeia de polipéptido de BMP-2 mais curto foi realizada com o objectivo de melhorar a estabilidade da proteína em vivo. Esta cadeia de proteína mais curta é a hipótese de facilitar o dobramento das proteínas, melhorando assim potencialmente a bioactividade de rhBMP2, aumentando a meia-vida da proteína [23]. No entanto, antes de testes em animais, uma caracterização completa desta sequência de aminoácidos mais curto foi investigada no comportamento das células in vitro. MC3T3-E1 pré-osteoblastos foram investigados quanto à sua resposta a cinco concentrações diferentes de rhBMP2_108 incluindo 10, 50, 100, 200 e 500 ml e, em comparação com controlo disponíveis comercialmente rhBMP2 a uma concentração de 100 ng /mL (R & amp ng /; D systems ). rhBMP2_108 foi testado quanto à sua capacidade para induzir recrutamento celular, proliferação celular, actividade de fosfatase alcalina, a coloração com vermelho de alizarina, bem como os níveis de ARNm que codificam para os genes da fosfatase alcalina, a osteocalcina, um colagénio e Runx2 como avaliado por PCR em tempo real.
Métodos
rhBMP2_108 sequência de aminoácidos
rhBMP2_108 foi gentilmente cedido pelo Jiuyuan empresa de biotecnologia (Hangzhou, China). A sequência de aminoácidos encurtado foi fabricado como se segue: MKKLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSKIPKACCVPTELSAISMLYLDENEKVVLKNYQDMVVEGCGCR para uma cadeia de proteína de 108 aminoácidos. A BMP-2 disponível comercialmente foi adquirido a R & amp;. D systems (Minneapolis, USA)
Preparação de BMP2
De acordo com a sequência de aminoácidos, a expressão intracelular de rhBMP2_108 em E. coli foi construído para a produção de grandes quantidades de rhBMP2_108 como anteriormente descrito [24]. Resumidamente, a sequência de BMP-2 foi concebido de acordo com a sua sequência de aminoácidos, e, em seguida, foi transcrito reverso com transcriptase reversa (Gibco BRL, Nova Iorque, EUA) como previamente descrito [24]. reacção em cadeia da polimerase (PCR) foi utilizada para amplificar o cDNA que codifica a proteína de sequência de aminoácidos rhBMP2_108 encurtado. Este cDNA foi então subclonado rhBMP2_108 utilizando um vector pRSET (A) (Invitrogen, UK) para se obter o pRSET (A) /vector de expressão rhBMP2_108. Em seguida, pRSET (A) /rhBMP2_108 foi ainda utilizado para transformar a estirpe de E. coli BL21 (DE3). Um bioreactor foi então utilizada para se obter o cultivo de células de alta densidade de E. coli. Resumidamente, a E. coli transformada foi cultivada num fermentador de 5 L, com 3 L de meio definido (cultura em lotes; extracto de levedura 1 g /L, peptona a 2 g /L) foi inoculada com a pré-cultura (10% do lote volume de cultura). O cultivo foi realizado com agitação a 250 rpm durante 48 h a 30 ° C, incluindo a adição de um meio nutriente (glicose 33,3 g /L, peptona a 10 g /L, extracto de levedura 5 g /l, MgSO
41 g /l, FeSO 48,0 g /l, CaCl 20,048 g /L, ZnSO 40,0176 g /l, CuSO 40,008 g /L).
A biomassa de cultura foi então colhida por esmagamento duas vezes as células numa prensa francesa e depois centrifugada. O sedimento foi ressuspenso em 25 mg de peso molhado /ml num tampão de suspensão (20 mMTris-HCl [pH 8,5], 0,5 mMEDTA, 2% [v /v] de Triton X-100). Os corpos de inclusão (pellets) foram ressuspensos num tampão de solubilização (6Mguanidine-HCl, Tris-HCl 0,1 M [pH 8,5], DTT 0,1 M, EDTA 1 mM) e depois incubada com agitação constante à temperatura ambiente durante a noite. partículas insolúveis foram então removidas a partir da suspensão por centrifugação.
Uma coluna 6 Fast Flow Heparina-Sepharose foi então usado para purificar o rhBMP2_108 activo (dímero). Um gradiente de NaCl contínuo (0,1-1,5 M) foi usada para eluir a proteína ligada. Em seguida, um gradiente de NaCl em degraus (0,15 M, 0,3 M e 0,5 M) foi usada para eluir a proteína e separar rhBMP2_108 activo. Posteriormente rhBMP2_108 pó foi congelado a-20 ° C. Quando utilizado, o ácido acético a 0,1% foi utilizada para dissolver o pó BMP2. Controlo rhBMP2 foi adquirido a R & amp; sistemas D (Minneapolis, USA) derivadas a partir de células CHO.
ensaio Bidimensional migração
linha de células pré-osteoblastos MC3T3-E1 foi usada para este estudo. Nenhuma amostra humanas ou animais foram utilizados e, portanto, não era necessário o consentimento ético. O ensaio de migração de células foi realizada com uma câmara de Transwell usando uma placa de 24 poços e policarbonato filtros Transwell (Costar, Corning, Acton, MA) com um tamanho de poro de 8 um, como anteriormente descrito [25]. 10 4 células MC3T3-E1 em 50 ul de DMEM foram semeadas no compartimento superior. rhBMP2_108 em concentrações de 0, 10, 50, 100, 200 e 500 rhBMP2 ng /ml e o controlo a 100 ng /ml foram semeadas no compartimento inferior. As células foram deixadas migrar durante 24 h a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO 2 atmosfera. O filtro foi então removido, as células foram fixadas em 4% de formaldeído durante 20 minutos e lavadas em PBS, depois as lavagens, os filtros foram incubados durante 15 min à temperatura ambiente com Methylrosanilnium solução de cloreto de (Wuhan Google Biotechnology Limited G1014 empresa), em seguida, os filtros foram lavou-se com PBS durante 10 min. As amostras foram examinadas por microscopia. As células não migradas no lado superior foram eliminados por lavagem do filtro com PBS frio e raspagem com um limpador de borracha. As restantes células migradas no lado inferior do filtro foram contados em nove campos aleatórios por filtro (100 × de ampliação). Todas as amostras foram realizadas em triplicado com 3 experiências independentes realizadas.
Ensaio de proliferação
Para investigar o efeito de rhBMP2_108 sobre a proliferação das células MC3T3-E1, CCK-8 para cada grupo de ensaio foi realizada como previamente descrito [26]. Resumidamente, as células foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 5 x 10 3 células /poço. Em pontos de tempo 1, 3 e 5 dias, o ensaio CCK-8 foi realizada por adição de 10 uL da solução de CCK-8 (Dojindo Molecular Technologies Inc., Japão) a cada poço e incubação durante 1,5 h de acordo com o protocolo do fabricante. A absorvância foi medida a λ = 450 nm num leitor de placas. Os resultados foram demonstrados como a absorvância de cada poço experimental menos o valor da densidade óptica dos poços do branco. Todas as amostras foram repetidos em triplicado com três experiências independentes.
Actividade da fosfatase alcalina
actividade da fosfatase alcalina foi analisada colorimetricamente, usando o kit de ensaio de fosfatase alcalina (Nanjing Jiancheng Bioengineering Insitute) usando uma densidade de sementeira inicial de 50.000 células por 24 bem prato, como previamente descrito [27, 28]. No ponto de tempo de sete e 14 dias, as células foram lavadas três vezes com PBS e solubilizadas em 0,1% de Triton X-100 (tamponado em 0,1 mol /L em PBS, pH 7,3) a 4 ° C durante 1 h. Após a ultra-sons e centrifugação, a actividade de ALP no sobrenadante foi determinada colorimetricamente usando leituras OD405 /OD562. A proteína total foi quantificada por Kit de ensaio de proteína BCA (Thermo Fisher Scientific Inc.). A actividade de ALP foi normalizada para a proteína total. As amostras foram corridas em triplicado com três experiências independentes realizadas.
-PCR em tempo real
células MC3T3-E1 foram semeadas a uma densidade de 2 × 10 5 e cultivadas durante 14 dias conforme anteriormente descrito [26, 28 , 29]. Os efeitos de rhBMP2_108 a várias concentrações foram investigados em quatro a expressão do gene relacionado com o osteogénico incluindo fosfatase alcalina (ALP), colagénio I (COL I), factor de transcrição relacionados com o enfezado dois (Runx 2) e osteocalcina (OCN). O ARN total foi extraído a partir de células MC3T3-E1 por reagente Trizol (TriPure Isolamento de reagentes, Roche Applied Science, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. A concentração e a qualidade das amostras de ARN total foi analisada por Nanodrop (Thermo Fisher Scientific Inc.). O DNA complementar foi sintetizado a partir de 2 ug de ARN total utilizando o kit RevertAidTm First Strand cDNA Synthesis (Fermentas) seguindo o protocolo do fabricante. RT-qPCR foi realizado em 20 reacções ul contendo 10 ul de SYBR Master Mix verde (Roche Applied Science, Alemanha), 0,6 mL (10 uM) de cada iniciador directo e inverso para cada um dos genes de interesse, 2 ul de molde de ADNc e 6,8 uL Água. As sequências dos iniciadores (mostrados na Tabela 1) foram concebidos especificamente de acordo com a referência. O gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (GAPDH), um gene de referência, foi utilizado como um controlo. A reacção foi analisada utilizando um sistema 7000 de sequência ABI Prism Detecção (Applied Biosystems), e a operação de amplificação por PCR durante 40 ciclos. Para validar a amplificação amplicon específico sem contaminação do DNA genômico, derretendo análise da curva foi realizada eo único vértice apareceu em torno da temperatura de recozimento. Os níveis de expressão relativos de cada gene desejado foram normalizados contra o valor de Ct de GAPDH e determinada usando o método Ct Delta. Todas as amostras foram determinados em triplicado por três sequências Primer independentes studies.Table 1 para marcadores de diferenciação de osteoblastos
GAPDH F
GTGAAGGTCGGTGTGAACGG
GAPDH R
TCCTGGAAGATGGTGATGGG
OPN F
GAGGAAACCAGCCAAGGTAAG
OPN R
AAAGCAAATCACTGCCAATCTC
OCN F
GAGGACCATCTTTCTGCTCACT
OCN R
CGGAGTCTGTTCACTACCTTATTG
ALP F
TGTGGAATACGAACTGGATGAG
ALP R
ATAGTGGGAATGCTTGTGTCTG
Runx2 F
GTGTTCCCTACTCAGCCGTC
Runx2 R
GAGGCCTCGGTCCACATTAG
Alizarina quantificação vermelho e Alizarina coloração vermelha foi realizada para determinar a presença de mineralização da matriz extracelular após 14 dias. As células MC3T3-E1 foram semeadas a uma densidade de 50000 células por placa de cultura de 24 cavidades contendo as várias concentrações de rhBMP2_108. Após 14 dias, as células foram fixadas em etanol a 96% durante 15 minutos e coradas com uma solução de 2% de alizarina vermelha em água (pH 4,2) à temperatura ambiente durante 1 h e visualizados sob microscopia de luz. Depois disso, a quantificação vermelho de alizarina foi dissolvida usando 200 ul de cloreto de cetilpiridinio a 1% (dissolvido em água destilada duas vezes) à temperatura ambiente durante 4 h. Em seguida, 100 ul de solução foi transferida para a placa de 96 poços em texto OD 560.
Análise estatística Todos
análise dos dados foi realizada utilizando o software GraphPad Prism6.0. distribuição normal dos dados da amostra foi assumida para o estudo e, portanto, o teste paramétrico foi analisada utilizando-se ANOVA e estatisticamente significantes valores foram adotados como p Art & lt; 0,05. Média e erro padrão (SE) foram analisados utilizando ANOVA de uma via com um teste post hoc com a análise de Tukey.
Resultados
Efeito da rhBMP2_108 sobre o recrutamento celular
A fim de investigar os efeitos de rhBMP2_108 sobre o recrutamento celular , uma câmara de Transwell foi utilizado em cinco concentrações diferentes de rhBMP2_108 (Fig. 1). Verificou-se que depois de um período de 24 horas, todas as concentrações de rhBMP2_108 rhBMP2 e de controlo foram capazes de aumentar significativamente o recrutamento de células de células MC3T3-E1, quando comparado com amostras de controlo. Pouca variabilidade entre as amostras foi observada demonstrar um forte potencial para todas as concentrações de rhBMP2_108 para induzir o recrutamento de células (Fig. 1). FIG. Um ensaio de recrutamento de células demonstraram que todas as concentrações de rhBMP2_108 foram significativamente capaz de melhorar o recrutamento de células MC3T3-E1, quando comparado com amostras de controlo sem rhBMP2 (Barra de escala = 100 pm). Todas as experiências foram realizadas em triplicado com três experiências independentes (n = 9
). Os dados representam médias +/- SEM. ** Indica a todas as amostras significativamente mais elevadas do que as amostras de controlo, p & lt
; 0,01)
Efeito de rhBMP2 sobre a proliferação celular
O efeito de rhBMP2_108 foi investigada em cinco concentrações e controlar rhBMP2 quanto à sua capacidade para estimular a proliferação de células in vitro (Fig. 2). Verificou-se que as células MC3T3-E1 demonstraram muito semelhante número de células de 1 dia após a inoculação, independentemente da concentração do meio de cultura de células de rhBMP2_108 (Fig. 2). Um ligeiro aumento no número de células foi observada aos 3 dias, no entanto, pôde-se observar nenhuma diferença significativa entre as várias modalidades de tratamento (Fig. 2). Aos 5 dias após a sementeira, foi observado um aumento significativo no número de células para as células MC3T3-E1 com todas as concentrações de rhBMP2_108 utilizadas neste estudo (Fig. 2). Curiosamente, não há vantagens pode ser encontrada para concentrações mais elevadas de rhBMP2_108 quando comparados com os seus homólogos inferiores (Fig. 2). FIG. 2 O número de células, como calculado por um ensaio de CCK-8 para as células MC3T3-E1 semeadas a várias concentrações de rhBMP2_108 quando comparado com o controlo de plástico de cultura de tecidos (Todas as experiências foram realizadas em triplicado com três experiências independentes (n = 9
). Dados representa meios +/- SEM # denota amostras de controlo significativamente mais baixos do que todas as outras modalidades de tratamento, p
& lt;. 0,05)
Efeito da rhBMP2 na diferenciação celular
RhBMP2_108 foi então avaliada pela sua capacidade de acelerar de osteoblastos a diferenciação em várias concentrações (Fig. 3, Fig. 4, a Fig. 5, Fig. 6). Em primeiro lugar, verificou-se que rhBMP2_108 foi capaz de aumentar significativamente a actividade de ALP em sete e 14 dias após sementeira para todas as concentrações de rhBMP2_108 (Fig. 3). Curiosamente, foi observada a 7 dias em que a actividade de ALP era significativamente maior em concentrações rhBMP2_108 de 50, 100 e 200 ng /ml, quando comparado com amostras de controlo (fig. 3). Aos 14 dias, todas as modalidades de tratamento que receberam rhBMP2_108 a várias concentrações demonstraram um aumento de 16 vezes na actividade de ALP marcado quando comparado com amostras de controlo vazio de rhBMP2_108 (Fig. 3). FIG. 3 actividade de ALP foi significativamente aumentada em sete e 14 dias após sementeira para as amostras inoculadas com rhBMP2_108 quando comparado com o controlo de plástico de cultura de tecidos (Todas as experiências foram realizadas em triplicado com três experiências independentes (n =
9). Os dados representam médias ± . /- SEM * denota diferença significativa entre 500 ng /ml e 10 ng /ml rhBMP2, p
& lt; 0,05; ** indica significativamente mais elevada do que todas as outras modalidades, p
& lt; 0,05, # indica a amostras de controlo significativamente mais baixas do que todas as outras modalidades de tratamento, p
& lt; 0,05)
fig. 4 níveis de ARNm de (a) ALP, (b) OCN, (c), COL-1 e (d) Runx2 para as células MC3T3-E1 semeadas a várias concentrações de rhBMP2_108 (Todas as experiências foram realizadas em triplicado com três experiências independentes (n < Br.> = 9) os dados representam médias +/- SEM * p indica a
. & lt; 0,05; ** indica significativamente mais elevada do que todas as outras modalidades, p
& lt; 0,05, # indica a amostras de controlo significativamente mais baixas do que todas outras modalidades de tratamento, p Restaurant & lt; 0,05)
Fig. 5 A análise qualitativa da coloração vermelha alizarin demonstrou aumento da mineralização para células MC3T3-E1 em concentrações crescentes de rhBMP2_108 aos 14 dias após sementeira
Fig. 6 A análise quantitativa de coloração vermelho de alizarina. rhBMP2_108 demonstram um aumento dependente da concentração na coloração vermelho de alizarina (Todos os experimentos foram realizados em triplicado com três experimentos independentes (n
= 9). Os dados representam os meios +/- SEM. * denota diferença significativa entre os dois grupos, p
& lt; 0,05; ** indica significativamente mais elevada do que todas as outras modalidades, p
& lt; 0,05, # indica a amostras de controlo significativamente mais baixa do que todas as outras modalidades de tratamento, p
& lt; 0,05)
que as células MC3T3-E1 foram avaliados para níveis de ARNm por PCR em tempo real para os genes que codificam para ALP, OCN, COL-1 e Runx2 a várias concentrações de rhBMP2_108 (fig. 4). Para gene que codifica Runx2, até um aumento de cinco vezes foi observada a uma concentração de 500 ng /ml, quando comparado com amostras de controlo com um aumento significativo em 100 e 200 ng /ml em comparação com concentrações mais baixas (Fig. 4a). Da mesma forma, COL-1 também demonstrou um aumento dependente da concentração na expressão do gene (Fig. 4b). Aqui no entanto, apenas até um aumento de duas vezes foi observado em relação a amostras de controlo (Fig. 4b). Observou-se que os níveis de mRNA de ALP foram mais de cinco vezes maior no dia 14 em concentrações de dez e 50 ng /ml rhBMP2_108 ao passo que numa concentração de 100 e 200 ng /ml de 20 vezes de aumento na actividade de ALP (Fig. 4c). A concentração mais elevada de 500 ng /ml demonstraram um aumento de 40 vezes na actividade de ALP, quando comparado com os meios de cultura sem rhBMP2 (Fig. 4c). A maior alteração vezes foi observada em níveis OCN em que um aumento de até 300 vezes foi observada quando em comparação com o respectivo controlo sem rhBMP2 (Fig. 4d).
Finalmente, a coloração com vermelho de alizarina foi usado para visualizar, in vitro mineralização (Fig. 5). Observou-se que, sem rhBMP2, MC3T3-E1 pré-osteoblastos não foram capazes de gerar qualquer mineralização visual, como observado por coloração com vermelho de alizarina (Fig. 5). Os efeitos da rhBMP2_108 demonstraram um aumento dependente da concentração significativa na coloração vermelha alizarin aos 14 dias após sementeira (Fig. 6).
Discussão
O objetivo do presente estudo foi investigar a bioactividade de um BMP2 recombinante mais curto (rhBMP2_108 ) sequência sobre o comportamento dos osteoblastos. O uso de rhBMP2 para tratamentos dentais e ortopédicos tem sido utilizada para uma série de procedimentos, incluindo fracturas da anca, cirurgias abertas reconstrutivas, assim como procedimentos guiadas de regeneração óssea em odontologia [30-33]. Apesar demonstrando promissor em resultados in vivo, a utilização do factor de crescimento tem tido uma mistura de sucesso quando utilizado para uso clínico. Algumas das principais preocupações levantadas com relação à utilização do fator de crescimento é a sua bioactividade transitória que tem sido sugerido poderia ser da ordem de minutos a horas [18].
Há três principais áreas de investigação que visam melhorar a bioatividade da factores de crescimento; 1) utilizando a terapia gênica, 2) melhorar a estabilidade da proteína ou 3) melhoria do sistema de fator de entrega de crescimento. Um método que se mostrou promissor no início para entrega de factor de crescimento é a de terapia genética onde a utilização de vectores virais, tais como adenovírus pode contornar muitas das limitações de fornecimento de proteínas por exibindo um elevado em termos de eficiência de transdução in vivo com um período de expressão relativamente curto [34 -38]. A sua principal vantagem é a proteína-sobre-expressa é construído dentro da célula principal organismos e, portanto, tem acesso a uma multiplicidade de proteínas dobrar capaz de embalar com precisão e entrega de factores de crescimento para os seus tecidos circundantes [25, 39, 40]. Apesar dos avanços feitos nesta área de pesquisa, o uso de terapia genética ainda é proibido pela FDA tornando seu uso clínico futuro no momento em um futuro abordagem otimista com nenhum calendário conhecida por sua eventual utilização. Além disso, foram mostrados estratégias recentes que utilizam peptídeos que mimetizam BMP2 sintéticos curtos para facilitar a regeneração óssea [41-44], porém a falta de relatórios clínicos que utilizam essas estratégias ainda está faltando.
Assim, torna-se vital para encontrar métodos alternativos que podem ser considerado apto para melhorias no fator de crescimento de bioatividade. No presente estudo, uma versão recombinante de novos BMP2 (rhBMP2_108) com uma sequência de aminoácidos mais curto. Antes de testes em animais no entanto, o teste in vitro foi realizado sobre a actividade celular. Verificou-se no presente estudo que r rhBMP2_108 foi primeiramente capaz de direcionar o recrutamento de células progenitoras, favorecendo início rápido e recrutamento de células dentro de 24 h (Fig. 1). O homing das células progenitoras e células-tronco é um dos estágios iniciais chave no início precoce de reparo de fratura e é um componente necessário de cicatrização de feridas de ósseas-defeitos. Como tal, a capacidade para rhBMP2_108 para acelerar a taxa e o número de células progenitoras para locais de defeitos é crucial para a reparação óssea.
Embora os efeitos como pode ser visto no presente estudo demonstrou que foi significativamente rhBMP2_108 capaz de induzir a proliferação celular, isto não foi observada de um modo dependente da concentração. Isto pode ser devido ao facto de que as células submetidas a diferenciação das células não são propensos a proliferar simultaneamente. Enquanto observações dependentes não muita concentração foi encontrado com o recrutamento ou a proliferação celulares, foram encontradas diferenças significativas para a diferenciação dos osteoblastos em resposta a rhBMP2_108. Foi observado que ao longo de um aumento de quatro vezes na actividade de ALP foram detectados com rhBMP2_108 e aumentos dependentes aumento da concentração no alizarina validado ainda mais a nossa hipótese de que rhBMP2_108 actua principalmente estimulando a diferenciação dos osteoblastos. Observou-se também que um aumento significativo em níveis de mRNA de ALP foi observada de um modo dependente da concentração. Curiosamente OCN, um marcador de diferenciação tardia de osteoblastos foi regulada a cerca de 300 vezes quando comparado com as amostras de controlo (Fig. 4b). Este achado provavelmente significa que os pré-osteoblastos MC3T3-E1 semeadas em poços de controlo sem rhBMP2 provável permaneceu células progenitoras e não se diferenciou em direcção da linhagem osteoblástica em todo o curso destas experiências. Isto é ainda mais evidente pelo facto de que as amostras sem rhBMP2 mostrou nenhum potencial mineralização nas experiências vermelho de alizarina (Fig. 5).
Embora os resultados do presente estudo confirmam os efeitos desta sequência de aminoácidos mais curta na pilha de rhBMP2_108 atividade, muita pesquisa continua a ser necessária a fim de validar estes resultados em um modelo animal antes do teste clínico. Ele permanece praticamente desconhecido se a actividade da proteína não será afectado in vivo por a sequência de aminoácidos encurtado e muita investigação futura investigar esta relação, tanto no que diz respeito à proteína duração meia-vida, bem como os seus efeitos subsequentes sobre a formação de osso têm de ser cuidadosamente avaliados. Além disso, a sua comparação com o que conduz rhBMP2 actualmente disponíveis no mercado com a aprovação da FDA também é necessário para proporcionar uma melhor compreensão sobre os efeitos do comprimento de aminoácidos da proteína sobre a bioactividade de proteas recombinantes.
Conclusão Os resultados do presente estudo demonstram que uma sequência de aminoácidos mais curto de BMP-2 recombinante (rhBMP2_108) retém propriedades bioactivas de BMP-2, quando comparado com disponível comercialmente rhBMP2 in vitro. Foi demonstrado que rhBMP2_108 foi capaz de estimular o recrutamento celular rápida de MC3T3-E1 pré-osteoblastos e apoiar a sua diferenciação para a linhagem dos osteoblastos de uma forma dependente da concentração. Futuro na pesquisa in vivo analisando o uso desta sequência de aminoácidos de rhBMP2_108 é agora necessário em defeitos ósseos criticamente porte. Além disso, a investigação sobre o sistema de entrega ideal este fator de crescimento são necessárias para potencialmente melhorar ainda mais a sua bioactividade para uso clínico
abreviações
rhBMP2:. Proteína morfogenética óssea recombinante
2
rhBMP2_108: cadeia polypetitde
curto de 108 aminoácidos das proteínas ósseas morfogenéticas recombinante dois
ALP:
fosfatase alcalina
OCN:
osteocalcina
COL-1:
colágeno 1
Runx2:
runt- fator de transcrição relacionada dois
GAPDH:
gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase
FDA:
food and Drug Administration
CHO:
ovário de hamster chinês
PCR:
reação em cadeia da polimerase
PBS :
solução tamponada de fosfato
HCl: ácido clorídrico
EDTA:
ácido etilenodiaminotetracético
NaCl:
cloreto de sódio
DMEM:
meio de eagle modificado por Dulbecco
BCA:
ácido bicincon�ico
OD:
pptical densidade
SE:
erro padrão
Declarações
Agradecimentos
Este projecto foi apoiado pelo Programa de New Century excelentes talentos na Universidade (NCET-11-0414), Excelente Fundação da Juventude de Hubei e os fundos da National Science Foundation Natural da China (81271108). artigo
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