medula óssea murina da arte abstracta
Fundo
estudos pré-clínicos suportam a hipótese de que os enxertos de tecido conjuntivo preservar o osso alveolar de reabsorção; os mecanismos celulares subjacentes, no entanto, permanecem desconhecidas. Os mecanismos celulares podem ser atribuídos à actividade de paracrina dos fibroblastos palatino. Foi, portanto, razoável sugerir que palatinas enxertos de tecidos conjuntivos reduzir a formação de osteoclastos.
Métodos
Para testar esta hipótese, os fibroblastos humanos palatinas foram examinadas quanto à sua capacidade para modular a formação de osteoclastos em culturas de medula óssea de murinos expostos a RANKL, M-CSF e TGF-β1. Osteoclastog�ese foi determinada por fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP), a coloração e a análise da expressão do gene. A formação de células apresentadoras de antigénio foi baseada na expressão de CD14 e moléculas costimmulatory de células apresentadoras de antigénio. A interacção parácrina de fibroblastos e a medula óssea foi modelada in vitro com inserções de membranas celulares-oclusiva.
Resultados Online em co-culturas sem contacto célula-a-célula, palatal fibroblastos causou uma diminuição na expressão do marcador de osteoclastos genes em células da medula óssea; receptores de calcitonina, catepsina K, armadilha, e receptores associados a osteoclastos. Além disso, o número de células multinucleadas positivas para TRAP foi diminuída na presença de fibroblastos. Notavelmente, os fibroblastos palatinas aumentou a expressão de CD14 e as proteínas co-estimuladora CD40, CD80, e CD86 em células de medula óssea. células da medula óssea não teve impacto considerável sobre genes de viabilidade de fibroblastos e marcador de proliferação. No que diz respeito à sua distribuição celular, os osteoclastos foram mais proeminentes no centro das membranas, enquanto que os fibroblastos acumulada imediatamente adjacente à fronteira da inserção formando uma estrutura em forma de anel sobre a superfície da placa de cultura.
Conclusão O
dados sugerem que os fibroblastos palatinas proporcionar um ambiente que reduz parácrina OSTEOCLATOGÊNESE e aumenta os marcadores de células apresentadoras de antigénio. Morover, o modelo parácrina revelou uma atividade conjunta entre fibroblastos palatais e células da medula óssea visualizadas pela distribuição de células característica nos dois compartimentos separados.
Palavras-chave
fibroblastos Palatinas Osteoclasto macrófagos co-cultura Insere Murino culturas de medula óssea de fundo
Palatinas enxertos de tecido conjuntivo são usados em periodontia para a cobertura da raiz e para o tratamento de defeitos de recessão gengival [1]. enxertos de tecido conjuntivo palatal, também têm sido propostas para melhorar os parâmetros estéticos quando óssea vestibular é fina ou reabsorvido em odontologia e próteses implante [2-6]. Dependendo da técnica utilizada, enxertos de tecidos conjuntivos palatal pode ser colocada em contacto directo com o osso alveolar. Surge a pergunta sobre o possível impacto das palatais enxerto de tecido conjuntivo no osso alveolar. Existe apoio de pelo menos fraco para um papel potencial do enxerto de tecido conjuntivo na preservação do osso subjacente. enxerto de tecido conjuntivo colocado no vestibular da parede óssea, imediatamente após a extração do dente, rendeu um razoável preservação dos tecidos duros [7]. Além disso, gengivais enxerto de tecido conjuntivo pode reduzir a reabsorção da crista marginal em modelos caninos [8]. Tomados em conjunto, ambos os estudos pré-clínicos suportam a hipótese de que enxertos de tecidos conjuntivos podem preservar o osso alveolar; o mecanismo celular subjacente no entanto permanece desconhecida.
O mecanismo celular podem ser atribuídos à actividade de paracrina dos fibroblastos palatino. Este pressuposto é suportado por experiências in vitro com fibroblastos gengiva isoladas e a sua capacidade para influenciar a osteoclastogénese, a formação de células de reabsorção óssea. Por exemplo, o meio condicionado obtido a partir de fibroblastos gengiva e os fibroblastos dos ligamentos periodontais inibir a formação de células semelhantes a osteoclastos em culturas de medula óssea de rato [9-11]. É, portanto, provável que os factores parácrinos libertados a partir de fibroblastos palatinas pode reduzir o processo de osteoclastogénese. Mais interessante é o de compreender o mecanismo molecular como os factores parácrinos libertados a partir de fibroblastos palatinas alterar a expressão de genes que representam osteoclastos, mas também células que apresentam antigénios, tanto as células precursoras hematopoiéticas fom originário.
Osteoclastogênese em culturas de medula óssea de murinos requer as presenças do activador do receptor do factor nuclear kappa B ligando (RANKL), M-CSF, e os respectivos receptores [12]. Os osteoclastos são tipicamente multinucleadas e expressar fosfatase resistente a tartarato ácido (TRAP), catepsina K (CatK) e o receptor da calcitonina (CTR). Os osteoclastos também expressam moléculas co-estimuladoras de activação a motivo de activação baseado em tirosina imunorreceptor (ITAM) via dependente [13]. receptor associado à osteoclastos (OSCAR) e receptor de disparo expressos em células mielóides (trem2) são os receptores que estão associados com as respectivas moléculas adaptadoras Fc cadeia do receptor gama comum (FcRγ) e DNAX de activação de proteína de 12 kDa (DAP12), respectivamente [13] . Quando a diferenciação se desloca para um fenótipo de macrófagos, a expressão de CD14, um co-receptor para a sinalização lipopolissacárido, e as proteínas co-estimuladoras CD40, CD80 e CD86, vulgarmente expresso em células apresentadoras de antigénios, tais como monócitos e macrófagos, subir [14, 15].
objetivo deste presente estudo piloto foi investigar o impacto do ambiente parácrina de fibroblastos palatais em osteoclastog�ese a partir de precursores da medula óssea utilizando um modelo in vitro, onde ambas as fontes de células são separadas por membranas oclusivos celular.
Métodos
fibroblastos palatal Humano
fibroblastos palatais humanos foram preparados a partir de culturas de explantes de três doadores independentes após a aprovação do comitê de ética da Universidade médica de Viena (EK Nr. 631/2007). Fibroblastos que cresceram a partir de explantes e não haviam sido submetidos foram utilizados mais de cinco passagens. Os fibroblastos foram cultivados em Dubeccos Modified Eagle Médium (DMEM) com antibióticos (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EUA)) e plaqueadas a 100.000 células /cm
2 nas respectivas placas de 12 poços (Greiner Bio-One GmbH) . Após o período de cultivo, a coloração do fibroblasto foi realizada com DiffQuik (Roche Diagnostic Systems, Basileia, Suíça).
Óssea de murinos culturas de medula
células da medula óssea foram preparados por lavagem de fémur e da tíbia de 4 a 8 semanas de idade do sexo feminino ratinhos Balb /c (BE76 /12 Veterinärdienst des Kantons Berna) e semeadas em inserções de cultura de células ThinCert ™ (12 formato bem com tamanhos de poro nominal de 0,4, uM; Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemanha) a um milhão de células por cm 2 em mínimo de Eagle Meio Essencial-alfa modificação (aMEM) suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS), antibióticos, M-CSF a 25 ng /ml, TGF-β1 em 10 ug /ml, e RANKL em 25 ug /ml. culturas de medula óssea foram depois transferidos para as placas que continham os fibroblastos. As proteínas recombinantes foram adquiridos a Prospec (Ness Ziona-, Israel). Células da medula óssea foram cultivadas com e sem a fibroblastos. Ambos os tipos de células permanecem separados pela membrana celular oclusiva das inserções de cultura de células ThinCert ™. A coloração para TRAP (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) foi executado no dia cinco. As células foram consideradas positivas quando os osteoclastos TRAP e para ter três ou mais núcleos, como observado por microscopia de luz.
Expressão de genes marcadores em culturas de medula óssea de murinos
O ARN foi isolado a partir de culturas de medula óssea e os fibroblastos palatinas utilizando a alta Pure Kit de Isolamento de RNA (Roche Applied Science, Rotkreuz, Suíça). A transcrição reversa (RT) foi realizada com transcriptor Universal ADNc mestre, e análises PCR foram realizadas em triplicado utilizando TaqMan Universal mistura de PCR Master (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) ou o FastStart Universal Sonda mestre Rox no Real-Time PCR System 7500 ( Roche). Células da medula óssea foram analisados para os seguintes genes: SybrGreen: RANK, C-FMS, TRAF6, C-fos, MITF, PU1, NFATC-1, DC-Stamp, ATP6V0D2, CD14, CD40, CD80, CD86, CD11c; TaqMan (Applied Biosystems, Carlsbad, CA): CTR, CATK, TRAP, OSCAR, trem2, DAP12, FCRγ. Fibroblastos foram analisadas para os seguintes genes: BCL2, PLK1, CCNB1, CCNE1, CCND1, MYBL2, GAPDH, BAD, BAX e BCL-XL. Os dados foram normalizados para a β-actina utilizando o método ΔΔCt (Tabelas 1 e 2) .table 1 SybrGreen Primers para RT-PCR
Gene
Atacante primário
Iniciador inverso
m 18 s
tccagcacattttgcgagta
cagtgatggcgaaggctatt
m βactin
ctaaggccaaccgtgaaaag
accagaggcatacagggaca
m POSTO
gtgctgctcgttccactg
agatgctcataatgcctctcct
m c-fms
gaccatggtgaatggtaggg
ggataacgttgaatcccactg
m TRAF6
ttgcacattcagtgtttttgg
tgcaagtgtcgtgccaag
m c-fos
gcaactttctatgacactgaaacac
tctctctagggctgcattgg
m MITF
gacaccagccataaacgtca
ttttccaggtgggtctgc
m PU1
ggagaagctgatggcttgg
caggcgaatctttttcttgc
m NFATc-1
ccgttgcttccagaaaataaca
tgtgggatgtgaactcggaa
m DC-Stamp
aagctccttgagaaacgatca
caggactggaaaccagaaatg
m Atp6vOd2
aagcctttgtttgacgctgt
gccagcacattcatctgtacc
m CD14
aaagaaactgaagcctttctcg
agcaacaagccaagcacac
m CD40
gagtcagactaatgtcatctgtggtt
accccgaaaatggtgatg
m CD80
tcgtctttcacaagtgtcttcag
ttgccagtagattcggtcttc
m CD86
gaagccgaatcagcctagc
cagcgttactatcccgctct
m CD11c
gagccagaacttcccaactg
tcaggaacacgatgtcttgg
h βactin
ccaaccgcgagaagatga
ccagaggcgtacagggatag
h BCL2
caggagaatggataaggcaaa
ccagccagatttaggttcaaa
h PLK1
aaccgagttattcatcgagacc
ttggttgccagtccaaaatc
h CCNB1
cctccggtgttctgcttc
ttcagcattaattttcgagttcc
h CCNE1
ggccaaaatcgacaggac
gggtctgcacagactgcat
h CCND1
gccgagaagctgtgcatc
ccacttgagcttgttcacca
h MYBL2
gtcaaatggacccatgagga
gtcagtgcggttagggaagt
h GAPDH
agccacatcgctcagacac
gcccaatacgaccaaatc
h BAD
cgagtttgtggactcctttaaga
caccaggactggaagactcg
h BAX
agcaaactggtgctcaagg
tcttggatccagcccaac
h BCL XL
agccttggatccaggagaa
agcggttgaagcgttcct
Tabela 2 TaqMan Primers Assay ID para RT-PCR
m CTR
Mm 00432282_m1
m CatK
Mm 00484039_m1
m TRAP
Mm 00475698_m1
m Oscar
Mm 00558665_m1
m trem2
Mm 04209424_g1
m DAP12
Mm 00449152_m1
m FcRγ
Mm 02343757_m1
análise estatística
As culturas celulares foram feitas utilizando, pelo menos, árvore diferente doadores de fibroblastos. Os dois grupos foram comparados com o teste t-pareado
com α & lt; 5%.
Resultados fibroblastos Palatinas inibir as células semelhantes a osteoclastos
caminho para determinar o impacto de fibroblastos palatal na osteoclastogênese, foi realizado um modelo de co-cultura parácrina baseado em inserções. A principal conclusão foi que a presença de fibroblastos palatinas na câmara inferior diminuiu a expressão dos genes marcadores típicos de osteoclastos CTR, CATK, TRAP e Oscar por cerca de 30% (p & lt;
0,05), mas não o outro co- estimuladoras de osteoclastogênese. RANK e c-fms, também permaneceu inalterada. Além disso, a coloração TRAP foi visivelmente reduzida na presença de fibroblastos palatal. número de osteoclastos em co-cultura com fibroblastos por região de interesse dizer, selecionados aleatoriamente em cada poço: 11,7 (SD 6.7). número de osteoclastos sem fibroblastos por região de interesse média foi de 53,0 (DP 12,8; p & lt;
0,05). Importante, a presença de fibroblastos palatinas aumentou a expressão de CD14 e as proteínas co-estimuladoras CD40, CD80 e CD86 em cerca de 2-4-vezes (p & lt;
0,05) em comparação com os respectivos controlos sem a presença de fibroblastos palatinas (Tabela 3). Deste modo, os dados apoiam o conceito de que os fibroblastos palatinas favorecer o desenvolvimento de células apresentadoras de antigénios em vez de um fenótipo de osteoclastos. células de medula óssea não afecta a viabilidade ou a proliferação dos fibroblastos do palato, tal como indicado pela análise de expressão de genes relacionados com apoptose e ciclo de células (dados não mostrados) .table 3 por RT-PCR de células semelhantes a osteoclastos (OCL) em co -Cultura com fibroblastos palato (FP) usando M-CSF, RANKL e TGF-β1 em comparação com co-culturas sem PF, com valores médios e desvio padrão
alvo genes
CD14
CD40
CD80
CD86
CTR
CatK
TRAP
OSCAR
Mean
3.13
2.48
1.57
4.31
0.63
0.71
0.75
0.62
Standard Deviation
0.66
0.82
0.53
1.42
0.31
0.34
0.31
0.30
Os genes foram aglomerado de diferenciação 14, 40, 80 e 86 (CD), a calcitonina do receptor (CTR), catepsina K (CatK), resistente ao tartarato Fosfatase ácida 5 (TRAP), um receptor do tipo imunoglobulina associado a osteoclastos (OSCAR). A tabela representa o desvio médio e padrão de N =
6 resultante a partir de duas experiências independentes com os fibroblastos a partir de três dadores diferentes. Todos os valores médios eram diferentes em comparação com controles sem fibroblastos (p & lt;
0,05)
distribuição característica dos osteoclastos e palatina fibroblastos na inserção culturas
fibroblastos Palatal teve um grande impacto sobre a distribuição dos osteoclastos. osteoclastos TRAP positivos foram proeminentes no centro do inserto (Fig. 1). Outro fenómeno ocorreu no sentido da distribuição dos fibroblastos palatino. Os fibroblastos acumulada imediatamente adjacente à fronteira da inserção, formando um anel de elevada densidade celular (Fig. 1). Estas observações suportam que basicamente palatino fibroblastos reduzir a formação de osteoclastos em um modo parácrino de acção, mas também que as células da medula óssea podem atrair fibroblastos in vitro. Assim, o modelo baseado em membranas parácrina oclusivos celular com células da medula óssea nas inserções e fibroblastos no compartimento inferior da placa de cultura revelou uma actividade mútuo visualizado pela distribuição de células diferenciais. FIG. 1 Coloração de fibroblastos em poços e as células semelhantes a osteoclastos em inserções após incubação de células de medula óssea de murídeo durante 5 dias com M-CSF, RANKL e TGF-β1 (MRT). culturas combinadas com fibroblastos e osteoclastos (A1) mostrou uma acumulação de fibroblastos imediatamente adjacentes à borda da peça inserta, formando um anel de fibroblastos a uma densidade celular elevada (A2, A3). Além disso, fibroblastos palatino teve um grande impacto sobre a distribuição dos osteoclastos: osteoclastos eram proeminentes no centro do inserto (A4, A5). Em culturas foram fibroblastos estavam presentes (B1, B2, B3), a TRAP-coloração de células semelhantes a osteoclastos mostraram uma redução no número e eram mais uniformemente distribuída em comparação com a osteoclastos células que tinham interacção com fibroblastos (b4, b5)
Discussão
a principal conclusão do estudo foi que os fibroblastos palatais criado um ambiente parácrina que moderadamente suprimida osteoclastog�ese enquanto mudando a diferenciação para um fenótipo de macrófagos. genes mestre osteoclastos foram regulados negativamente na presença de fibroblastos, enquanto que os genes característicos para as células apresentadoras de antigénio foram regulados positivamente. RANK e c-fms permaneceu inalterado, sugerindo que a mudança de diferenciação não pode ser explicado por uma redução na capacidade de resposta para os respectivos ligandos, com M-CSF também ser crítico para o desenvolvimento de monócitos. Além disso, observou-se uma característica de distribuição de células in vitro, com osteoclastos restantes nos centros das peças insertas, enquanto que os fibroblastos acumulada numa estrutura em forma de anel.
Estes resultados in vitro são interessantes porque basicamente apoiam as observações de estudos pré-clínicos que enxertos de tecidos conjuntivos reduzir a reabsorção da parede óssea bucal [7, 8]. Não é surpreendente que reduziu osteoclastog�ese vai junto com um deslocamento para as células apresentadoras de antigénio. Observações semelhantes foram feitas com saliva [15], e também doxiciclina e minociclina induziu a expressão de marcadores de células dendríticas, CD11c e CD86, em células de medula óssea na presença de RANKL [14]. Tomados em conjunto, os dados fornecem insights sobre um possível mecanismo parácrino sobre como fibroblastos palatino pode reduzir a osteoclastogénese enquanto apoiar simultaneamente imunidade inata indicado pela expressão de marcadores de células apresentadoras de antigénio, pelo menos in vitro. É evidente que esta não é uma conclusão, mas sim uma sugestão apoiada ser a nossa dados preliminares. Assim, os dados in vitro e particularily a possível relevância clínica devem ser interpretados com cuidado.
O estudo piloto tem outras limitações. Este é um estudo observacional que mostra um fenômeno, enquanto que os mecanismos moleculares subjacentes permanecem obscuros. Os factores libertados pelos fibroblastos palatinas que são responsáveis para a mudança observada de osteoclastogénese para a formação de células apresentadoras de antigénios, ainda não definido mais pormenorizadamente permanece a ser determinada. Um provável candidato é osteoprotegerina, um chamariz-receptor para a RANKL [12]. A osteoprotegerina é produzido por fibroblastos, mas para os quais se prolongam e, se de todo, este factor causou a inibição da osteoclastogénese é ainda pouco claro. Além disso, foi utilizado um sistema xenogénico, o que pode ter afetado o resultado global; fibroblastos palatais humanos e células da medula óssea do rato. No entanto, as moléculas que desempenham um papel na diferenciação dos osteoclastos são evolutivas conservada e, portanto, trabalhar inter-espécies [16]. Portanto, a utilização de células de medula óssea de ratinho em combinação com fibroblastos humanos, é apropriada como uma experiência à prova-de-princípios que pode ser refinada por utilização futura de inter-espécies em modelos in vitro.
Conclusões No seu conjunto, a presente estudo piloto é uma base científica para futuras pesquisas com o objetivo de revelar o impacto do ambiente parácrina de fibroblastos palatais em osteoclastogênese e do respectivo impacto sobre o sistema imunológico inato. O presente estudo é também uma cartilha para um estudo mais aprofundado da dinâmica do movimento celular criado pelo ambiente parácrina mútuo.
Disponibilidade de dados e materiais
Os conjuntos de dados que suportam as conclusões deste artigo são incluídas no artigo.
declarações
Agradecimentos
Nós gostaríamos de agradecer a Catherine Solioz por sua assistência. O estudo foi apoiado por um ITI Grant 852_2012
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concorrentes. interesses
os autores declaram que não têm interesses conflitantes contribuições
dos autores
VV realizados os experimentos e escreveu juntamente com RG do manuscrito.; RG planejado o desenho do estudo, JCS ajudou a estabelecer os métodos e workted sobre os números. AS ajudou a elaborar e revisar o manuscrito. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.
