histológico da arte abstracta
Fundo
carcinoma de células escamosas é o tumor maligno mais importante com o site principal na via oral cavidade e, dada a grande exposição da mucosa e os lábios aos fatores etiológicos desta neoplasia, sua incidência é alta. Investigação dos determinantes de prognóstico é significativa para as expectativas de proposta de tratamento e cura do paciente. A resposta imune local representado por infiltrado inflamatório peritumoral é um possível fator prognóstico.
Métodos
Neste estudo, amostras de mucosa oral de carcinoma de células escamosas foram analisados, separados de acordo com sua classificação histológica, bem como o perfil fenotípico da as células que compõem o infiltrado inflamatório peritumoral foi investigada pelo método de imuno-histoquímica, no vício, o índice de proliferação celular via expressão Ki67 proteína foi determinada.
resultados
os linfócitos T compunham a maior parte deste infiltrado inflamatório, e entre estas células, há predomínio de T CD8 dos linfócitos em relação aos linfócitos T CD4. Os lymhocytes B foram o segundo tipo de célula mais leucócitos visualizados seguido de macrófagos e neutrófilos. A avaliação imunohistoquímica de 67 de Ki-células positivas revelou uma maior expressão desta proteína em amostras de carcinoma indiferenciado de células escamosas.
Conclusão Os resultados sugerem que a resposta imunitária celular é o principal mecanismo de defesa em células de carcinoma escamoso oral, mucosa, expressa pelo grande número de linfócitos T e macrófagos, e que a maior intensidade da resposta local pode ser associado com o melhor prognóstico
material suplementar Electrónicas | a versão online deste artigo (doi:. 10. 1186 /1472-6831-8-25) contém material suplementar, que está disponível para usuários autorizados.
Fundo
as neoplasias malignas da boca formam um grupo heterogêneo de lesões que diferem entre si quanto a fatores, clínicos risco aspectos e origem histológica. Entre os diferentes tumores deste grupo, carcinoma de células escamosas é o tipo histológico mais prevalente e representa a maioria dos casos de câncer bucal diagnosticados [1-4]. Apesar das campanhas de prevenção de vários programas de saúde governamentais e expansão da rede de profissionais especializados que priorizam o diagnóstico de lesões pré-malignas da boca nos diferentes serviços de saúde atualmente ativos, 7% da população mundial sofre de câncer oral, e é, portanto, um problema de saúde em todo o mundo [4].
escamosas origina células de carcinoma do epitélio que reveste a boca. Este facto é extremamente importante quando se considera a exposição constante da cavidade oral a estímulos intrínsecas locais associados com o risco aumentado de este tipo de cancro. Entre os principais fatores de risco, tabagismo, consumo de bebidas alcoólicas crônica e traumas mecânicos crônicas - como próteses dentárias mal adaptados e dentes fraturados - se destacar. Além disso, como o cancro primário dos lábios, especialmente da parte inferior, devemos considerar a exposição contínua a radiação solar como um fator extrínseco significativa, especialmente em indivíduos leucodérmicas. Além de fatores intrínsecos e extrínsecos locais, a predisposição genética do paciente e da resposta imune são fatores determinantes do risco de câncer [2, 4-10].
Além da intensificação das actividades de prevenção, vários estudos têm sido desenvolvidos para estabelecer os fatores determinantes do prognóstico para essas lesões com o objetivo de minimizar a morbidade ea mortalidade causada pela lesão maligna existente. Muitos autores têm investigado a possível correlação entre a resposta do paciente imune, o comportamento neoplásico, e prognóstico [5, 11, 12].
Meneses et al., (1998) demonstraram, em amostras de carcinoma de células escamosas orais, uma possível associação entre o tamanho do tumor, a área de invasão, angiogénese, e a caracterização fenotípica do infiltrado inflamatório peritumoral predominantemente constituída por linfócitos T e linfócitos B. Coussens et al., (1999) também encontraram nos carcinomas de mucosa oral uma associação entre o predomínio de mastócitos no infiltrado peritumoral e um maior desenvolvimento da angiogênese do estroma, o que proporcionaria fornecimento de sangue adequado para a nutrição neoplásica e, consequentemente, uma prognóstico pobre.
Juntamente com a avaliação do infiltrado inflamatório peritumoral e dos seus produtos, o estudo da cinética celulares tumorais, os seus mecanismos de regulação e a sua inter-relação com factores de crescimento, oncogenes e anti-oncogenes também foi alvo de várias estudos [8, 15-19].
Entre os eventos celulares que determinam directamente progresso clínico do tumor, proliferação celular é significativa, ou seja, distúrbios no número de células resultantes de disfunções do ciclo mitótico [20, 21].
a actividade proliferativa de qualquer tecido ou neoplasma pode ser determinada pela sua taxa de crescimento utilizando anticorpos dirigidos contra antigénios específicos expressos por proliferação de células neoplásicas, que permite a análise simultânea de proliferação celular e histologia [13, 22, 23]. A molécula de Ki67 foi o marcador antigénico de escolha, uma vez que ele não sofre muito influência de factores internos e externos, e a sua expressão nuclear durante um determinado período do ciclo da célula representa uma vantagem na sua utilização como marcador biológico da actividade mitótica [ ,,,0],24-27].
recentemente demonstrou-se que o Ki-67 gene sofre "sobre-expressão", em células epiteliais de lesões orais pré-malignas e malignas.
neste estudo, o índice de proliferação celular foi avaliada por meio do expressão da proteína Ki-67 e o perfil fenotípico das células que compõem o infiltrado inflamatório peritumoral em amostras de células de carcinoma escamoso da mucosa oral. Os resultados demonstraram uma participação vital da população de linfócitos T na composição do infiltrado inflamatório associado com a área neoplásica. Estes resultados também sugerem uma correlação entre a intensidade da reacção inflamatória peritumoral e a proliferação de células tumorais.
Métodos
amostras de mucosa oral carcinoma de células escamosas de pacientes submetidos a tratamento naïve biópsias incisionais de diagnóstico. amostras bloqueada em parafina (n = 30) foram obtidos dos arquivos do Laboratório de Anatomia Patológica da Faculdade de Medicina da Arcoverde Fundação Dom André -. Valença /RJ
Os blocos foram processados histologicamente para obter fatias de 4 mm de espessura e corados com hematoxilina rotina e eosina (HE).
as lâminas foram avaliadas por dois examinadores diferentes, e os tumores foram classificados histologicamente de acordo com a Classificação Internacional de Doenças para Oncologia (CID-o /2000). As amostras foram divididos nos seguintes grupos:
Grupo 1: bem diferenciado células carcinoma escamoso da mucosa oral (n = 10)
Grupo 2: moderadamente diferenciado carcinoma de células escamosas da mucosa oral (n = 10)
grupo 3:. células escamosas indiferenciadas carcinoma da mucosa oral (n = 10)
histomorfometria do infiltrado inflamatório
a fim de quantificar o infiltrado inflamatório peritumoral, software Scion image eo software FotoScan foram utilizados para a captura e morfometria de imagem o infiltrado inflamatório. Todas as amostras foram capturados na extensão total e campos (ampliação original 100 ×) com áreas inflamadas em torno do tumor foram medidos semi-automaticamente, com selecção manual da região inflamada e análise computadorizada da área seleccionada.
Com base na análise de cada amostra, aritmética simples significa a área inflamada por campo microscópico foram obtidos e os resultados foram expressos em porcentagem de inflamação área peritumoral por grupo
Análise imuno-histoquímica
Fatias com 4 mm de espessura dispostos em lâminas silanizadas (3-aminopropiltrietoxissilano.; Sigma Chemical, Co., EUA), foram desparafinados em uma câmara de 60 ° C, e sequencialmente hidratado em passagens através xilol, álcool absoluto, álcool a 70%, e água destilada
A peroxidase de avidina-biotina método complexo anti-peroxidase clássico. foi utilizado no estudo das amostras. As amostras foram submetidas a recuperação de antigénios com a imersão dos fragmentos em tampão de citrato 0,001 M, pH 6,0, e bloqueio da peroxidase com peróxido de hidrogénio a 3% e posteriormente incubadas durante 1 hora com os anticorpos primários indicados na Tabela 1. Em seguida, elas foram incubadas com secundária anticorpos biotinilados, durante 30 minutos e submetido a uma reacção com o complexo de avidina-biotina durante mais 30 minutos. A coloração foi realizada pela adição do cromogénio diaminobenzidina (DAB) substrato para cerca de 1 minute.Table 1 Anticorpos para Antibody análise imuno-histoquímica de marcação Marca
Anti CD20
Linfócitos B
Dako
Anti CD3
linfócitos T
Dako
Anti CD8
reguladora linfócitos T
Dako
Anti CD4
Helper linfócitos T
Dako
Anti CD15
neutrófilos
Dako
Anti CD68
macrófagos
Dako
Anti Ki67
proliferação celular
Dako
controle negativo da reação imuno-histoquímica foi realizada por omissão de incubação com o anticorpo primário para algumas fatias. As fatias foram analisados e fotomicrografias foram realizadas com o sistema Nikon Microphot (Tóquio, Japão).
Contagem celular reactiva para cada anticorpo foi feita por varrimento de toda a amostra, com 400 × ampliação, com uma contagem de células positivas em todos os campos. Os resultados foram obtidos a partir da média aritmética simples e expressa em percentagem de células positivas por campo microscópico
Análise Estatística
análise estatística foi realizada utilizando Mann-Whitney com um p & lt.; nível de significância de 0,05, a fim de avaliar comparativamente meio dos parâmetros analisados nos diferentes grupos do experimento.
Resultados
A análise histopatológica das fatias coradas com hematoxilina e eosina (HE) e submetidos à análise morfométrica revelou que a significa percentagem de peritumoral área inflamada por campo microscópico foi de 24,7% no Grupo 1 (amostras de bem diferenciado carcinoma de células escamosas da mucosa oral) (Figura 1a), 33,2% no Grupo 2 (amostras de moderadamente diferenciado carcinoma de células escamosas da via oral mucosa) (Figura 1B), e 42,6% no Grupo 3 (amostras de carcinoma indiferenciado de células escamosas da mucosa oral) (Figura 1C). Após avaliação estatística, a quantidade de área inflamada peritumoral mostrou uma diferença estatisticamente significativa quando os grupos 1 e 3 foram comparados (P & lt; 0,05) (Figura 2). A Figura 1 classificação morfológica de células escamosas da mucosa bucal. A: bem diferenciado carcinoma de células escamosas da mucosa bucal. mancha N = 10. HE. Ampliação original x 200. B: carcinoma de células escamosas moderadamente diferenciado da mucosa bucal. mancha N = 10. HE. Ampliação original x 400. C: carcinoma de células escamosas indiferenciado da mucosa bucal. mancha N = 10. HE. ampliação original de 400 ×.
Figura 2 Intensidade de infiltrado inflamatório peritumoral. Os valores são expressos em aritmética simples significa sd ±. foi observada diferença estatisticamente significativa quando os grupos 1 e 3. p ≤ 0,05 comparado.
Em todas as amostras avaliadas neste estudo, a predominância quantitativa do infiltrado inflamatório esteve diretamente associada com áreas de maior invasão nos tecidos subjacentes ao parênquima tumor .
a avaliação fenotípica do infiltrado peritumoral foi realizado por identificação de positividade de células inflamatórias, caracterizado por a visualização de luz coloração intracelular Brown, contra um contra-coradas com hematoxilina em cada uma das reacções para os anticorpos utilizados de fundo.
Em todos os grupos, a análise da análise imuno-histoquímica revelou a presença de uma reacção inflamatória constituído predominantemente por células inflamatórias mononucleares. Os linfócitos T fez-se a maior parte deste infiltrado inflamatório, e entre estas células, houve uma predominância de linfócitos T CD8 em relação aos linfócitos T CD4 (Figura 3A). Os linfócitos B foram a segunda mais visualizado tipo de célula de leucócitos (Figura 3b), seguido de macrófagos (Figura 3d) e de neutrófilos (Figura 3C). Figura 3 Imuno-histoquímica para caracterização fenotípica de infiltrado inflamatório peritumoral. A: linfócitos T (CD3 +). Ampliação original x 400. B. A: linfócitos B (CD20 + células). Ampliação original x 400 C. A: Os neutrófilos (CD15 + células). Ampliação original x 400 D. A: Os macrófagos (células CD68 +). . ampliação original 400 ×
Não houve diferença significativa quando os tipos de leucócitos dos três grupos foram comparados (P & gt; 0,05) (Figura 4). Figura 4 perfil celular do infiltrado inflamatório peritumoral. Os valores são expressos como médias aritméticas ± simples SD. Não foi observada diferença estatisticamente significante quando comparados os grupos. p ≤ 0,05. Online em amostras de pacientes do Grupo 1, a avaliação imunoistoquímica da proteína Ki-67 revelou células tumorais escasso imunorreactivos (20% ± 3,2) (Figura 5), enquanto que nas amostras dos pacientes do grupo 2, células com positividade foram mais abundantes (47% ± 6,3). Em amostras de pacientes do Grupo 3, as células marcadas positivamente representado 60,3 ± 2,8% das células de tumores malignos. A comparação entre as percentagens de células tumorais positivas para Ki-67 por campo microscópico nas amostras de mucosa oral dos três grupos apresentaram diferenças estatisticamente significativas (p & lt; 0,05) (Figura 6). Os tumores do Grupo 3 mostrou uma maior expressão da proteína Ki-67 em comparação com os tumores dos grupos 1 e 2. A Figura 5 A imunohistoquímica demonstra a expressão de proteína Ki-67 em células de tumores malignos de amostras de mucosa oral carcinoma de células escamosas. A: carcinoma bem diferenciado. Ampliação original x 400. B: carcinoma moderadamente diferenciado. Ampliação original x 400. C: carcinoma indiferenciado. ampliação original de 400 ×.
Figura 6 A expressão da proteína Ki67 por grupo. Os valores são expressos em aritmética simples significa sd ±. foi observada diferença estatisticamente significativa quando comparados os grupos. p ≤ 0,05.
Discussão
carcinoma de células escamosas é o tipo mais comum de câncer da mucosa oral, e representa 91% dos casos diagnosticados de tumores malignos da boca [2, 6-8].
para além da etiologia multifactorial envolvendo factores extrínsecos e intrínsecos, estado imune do doente é também considerada para influenciar o risco de cancro e determinar vários aspectos da sua progressão [4, 9, 10]. Na década de 1980, Scully C. (1983) já tinha reconhecido o envolvimento da resposta imune no desenvolvimento de tumores malignos da boca, e havia enfatizado que o tratamento do cancro futuro seria baseado em imunoterapia através da imunomodulação.
Entre os eventos que, direta determinar tumor progressão clínica, as de importância primária incluem distúrbios no número de células resultantes de disfunções do ciclo mitótico e possíveis falhas "na evasão da resposta imune do hospedeiro dos tumores - avaliada pela intensidade do infiltrado inflamatório peritumoral, composição de células inflamatórias, a produção de citocinas pelas infiltrar células e presença de angiogênese [11, 12, 14, 20, 21].
de acordo com Costa L. et al., (2005) em um estudo clínico retrospectivo com 38 amostras de carcinoma de células escamosas oral, o TNM (estadiamento do tumor determinado pelo tamanho do tumor primário e a presença de metástases) classificação correlaciona-se com as características principais dos histopatológicos de classificação tumoral - grau de queratinização, pleomorfismo nuclear, e a intensidade da infiltração linfocítica peritumoral, e a ligação entre estes dados é importante na determinação do prognóstico e a escolha de tratamento.
Estes resultados mostraram uma correlação inversa entre o grau de diferenciação do tumor e a taxa de proliferação celular obtido pela expressão de proteína de Ki67. Resultados semelhantes aos encontrados neste estudo são também sugeridas por Costa et al., (2005), em carcinomas orais, Glen et al., (2006) em lesões pancreáticas malignas, Deans et ai., (2006) em cancros gastro-esofágico , e Cai et ai., (2006) no carcinoma de células de transição da bexiga. Os tumores indiferenciados mostrou uma expressão acentuada da proteína Ki-67. Aguiar (1996) demonstraram que o índice mitótico aumenta progressivamente a partir de mucosa oral peritumoral normal, para as áreas tumorais, bem como nas zonas de maior invasão tecidual [7]. . Pich et al, (2004) em um estudo retrospectivo com lesões malignas da cavidade da boca, glândulas salivares, faringe e laringe, observou que a atividade proliferativa investigado por diferentes métodos - como a determinação do índice de AgNORs e MIB-1 e Ki67 expressão por imuno-histoquímica - é clinicamente relevante e válido para a proposta de tratamento e definir o prognóstico. Neste papel, as características histológicas apresentaram pelo tumor maligno foram associados com a agressividade clínica pela análise do grau maligna relacionada com possíveis determinantes de prognóstico lesão -. Perfil imunológica local e proliferação de células malignas
De acordo com os resultados obtidos a partir de morfometria do infiltrado peritumoral, a percentagem média de área inflamada por campo microscópico foi maior nos tumores indiferenciados (Grupo 3), quando comparado com as médias das amostras de tumores moderadamente diferenciados (Grupo 2), seguidas pelas amostras de tumores bem diferenciados ( Grupo 1). Na avaliação destes dados, notamos que há uma correlação entre o mais alto grau de malignidade e a maior intensidade inflamatória.
A caracterização da composição infiltrado peritumoral não revelou uma diferença entre os tipos de leucócitos dos três grupos, determinados a partir de suas notas, mas, curiosamente, as quantidades de cada tipo de célula foram igualmente proporcional nestes grupos. Nota-se que em todas as amostras, o número total de linfócitos T e macrófagos predominaram sobre a quantificação dos plasmócitos, caracterizando reacção local do paciente como uma resposta imunitária predominantemente tipo de célula.
Para além da avaliação da intensidade e infiltrado inflamatório peritumoral os seus componentes celulares, alguns dos principais factores determinantes da agressividade do tumor e possíveis preditores de prognóstico são alterações na proliferação de células, isto é, alterações no número de células resultantes de disfunções do ciclo mitótico. Esta actividade proliferativa neoplásico pode ser determinada pela taxa de crescimento por meio da expressão de Ki67 [18-21, 28-31].
A comparação entre as percentagens de células tumorais positivas para a expressão de Ki-67 por campo microscópico no amostras de mucosa oral dos três grupos apresentaram diferenças estatisticamente significativas. As amostras do Grupo 3 (indiferenciado carcinoma de células escamosas da mucosa oral) exibiu uma expressão maior de células marcadas positivamente, seguido pelas amostras de pacientes do Grupo 2 (moderadamente diferenciado carcinoma de células escamosas da mucosa bucal), e a partir do Grupo 1 ( bem diferenciadas células carcinoma escamoso da mucosa oral).
Como a caracterização de leucócitos, Sica et ai., (2006) relataram evidências associada à predominância da população de macrófagos no infiltrado peritumoral e uma maior promoção de angiogénese tumoral, atribuindo para essas células um papel pró-tumoral, e consequentemente, um mau prognóstico.
nas amostras estudadas de carcinoma oral, a avaliação de células inflamatórias peritumorais demonstrada a importância da imunidade celular na resposta antineoplásico local, devido à presença de um população predominantemente composto por linfócitos T e macrófagos, embora sem diferenças relevantes quanto à composição infiltrado de acordo com a classificação histológica.
recentemente, em amostras de cancro da mama invasivo, foi investigada a possível correlação entre a intensidade do infiltrado inflamatório peritumoral e o grau de diferenciação tumoral [32]. Ressalta-se que, quando analisamos pacientes com tumores malignos do mesmo grau, aqueles que evoluiu de forma satisfatória mostrou uma mais intensa resposta inflamatória peritumoral, enquanto aqueles que apresentam recaídas e disseminação tumoral metastático desenvolveu uma menos intensa resposta inflamatória peritumoral.
Conclusão
neste estudo, o paralelo entre a intensidade da inflamação e prognóstico do paciente ainda não foi totalmente esclarecido, e é necessária mais investigação. A distribuição das amostras de carcinoma da mucosa oral em grupos foi feita de acordo com a graduação histológica. Os resultados sugerem uma correlação positiva entre a intensidade da resposta inflamatória eo grau de diferenciação do tumor. Portanto, tumores indiferenciados apresentar um maior desenvolvimento do processo inflamatório peritumoral, quando comparado a moderadamente diferenciadas e bem diferenciadas tumores. No entanto, a fim de definir esta variável de a intensidade da resposta inflamatória como um factor de prognóstico no cancro oral, outros estudos deve ser efectuada de modo que a intensidade da resposta local e proliferação de células malignas em tumores da mesma classificação histopatológica associado aos pacientes ' o progresso clínico pode ser avaliada.
Finalmente, os resultados apresentados neste estudo sugerem que a resposta imunitária celular é o principal mecanismo de defesa no carcinoma de células escamosas da mucosa oral, expressa pelo grande número de linfócitos T e macrófagos.
Nós sublinham ainda que Ki-67 está relacionado com o índice mitótico e, consequentemente, a proliferação celular e classificação maligno da neoplasia.
Agradecimentos
Rede Mineira de bioterismo. 2824/05 - FAPEMIG; Rede Mineira "TOXIFAR". 2827/05 - FAPEMIG; CNPQ
Declarações
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os autores declaram que não têm interesses conflitantes.
autores' contribuições
FLDV e BJV participaram do projetada do estudo, estudo imuno-histoquímico e estudo histopatológico . FMA e MAMG participou da concepção e coordenação.
