Abstract
Fundo
As bactérias probióticas são sugeridas para desempenhar um papel na manutenção da saúde bucal. bactérias que promovem tais saúde são adicionados a diferentes produtos probióticos comerciais. O objectivo do estudo foi investigar a capacidade de uma variedade de estirpes de lactobacilos, utilizado em produtos probióticos disponíveis comercialmente, para inibir o crescimento de Streptococcus mutans oral e C. albicans in vitro
.
Métodos
Oito probiótico estirpes de lactobacilos foram testados para a inibição do crescimento de três estirpes de referência e dois isolados clínicos de Streptococcus mutans, assim como duas estirpes de referência e três isolados clínicos de Candida albicans
com um método da sobrecamada de ágar.
resultados
em concentrações que variam a partir de 10
9-10 5 CFU /ml, todas as estirpes de lactobacilos inibiu o crescimento de estreptococos mutans completamente com a excepção de L. acidophilus
La5 que executado apenas uma ligeira inibição de algumas estirpes em concentrações correspondentes a 10 7 e 10 5 CFU /ml. Na concentração de células menor (10 3 UFC /mL), apenas L. plantarum
299v e L. plantarum
931 exibido uma inibição total de crescimento enquanto que uma ligeira inibição foi observada para todas as cinco estirpes de estreptococos mutans por L. rhamnosus
LB21, L. paracasei
F19, L. reuteri
PTA 5289 e L. reuteri
ATCC 55730. Todas as cepas de lactobacilos testados reduziu o crescimento candida mas o efeito foi geralmente mais fracos do que para estreptococos mutans. Os dois L. plantarum
tensões e L. reuteri
ATCC 55730 apresentou a inibição mais forte em Candida albicans
. Não foram observadas diferenças significativas entre as cepas de referência e os isolados clínicos.
Conclusão
As cepas probióticas selecionadas mostraram uma capacidade significativa, mas um pouco variando para inibir o crescimento de estreptococos mutans oral e Candida albicans in vitro
.
Fundo
bactérias probióticas, definidas como "microrganismos vivos que, quando administrados em quantidades adequadas que conferem benefícios à saúde do hospedeiro" (FAO /WHO, 2001), são sugeridos para desempenhar um papel na manutenção da saúde bucal [1, 2 ]. bactérias que promovem tais saúde são adicionados aos diferentes produtos lácteos comerciais, tais como leite, queijo e iogurte, bem como gomas de mascar e bebidas de frutas. As ações possíveis de bactérias probióticas no ambiente oral são a concorrência de sítios de ligação, a produção de substâncias antimicrobianas e ativação e regulação da resposta imune [3]. antagonismo bacteriano pode ocorrer quando o crescimento de uma espécie bacteriana é dificultada pelos componentes produzidos por uma outra espécie. bactérias do ácido láctico produzir componentes antimicrobianos [4, 5] e alguns têm a capacidade de produzir peróxido de hidrogênio (H 2O 2) que pode ser tóxico para os organismos que produzem pouco ou nenhum H 2O 2 -scavenging enzimas analisa.
Molecular da microbiota bucal em crianças pré-escolares têm mostrado que Streptococcus mutans
é significativamente associados à cárie precoce na infância [6]. Candida albicans
é um membro persistente da microbiota bucal em crianças com cárie [7] com uma resposta de crescimento substancial para a exposição de sacarose [8]. C. albicans
produzir ácidos orgânicos, tais como piruvato de etilo e e são considerados como tendo uma contribuição significativa para a cárie pathogenisis [9]. Os lactobacilos jogam um papel significativo no ecossistema oral e pode ser ligada com a doença oral, bem como a saúde bucal [10]. Desde a descoberta por Polonskaya [11] que o L. acidophilus
inibe o crescimento de certos estreptococos
in vitro, ensaios clínicos confirmaram que os lactobacilos probióticos podem reduzir as contagens de estreptococos mutans salivares após a ingestão de L. rhamnosus
GG [12, 13] e L. reuteri
[14-16]. Além disso, de ocorrência natural de Lactobacillus
espécies, incluindo L. paracasei, L. plantarum Comprar e L. rhamnosus
, pode inibir o crescimento de estirpes laboratoriais de estreptococos mutans, bem como mutans autólogo estreptococos do sujeito in vitro
[17]. Hatakka et al [18] descobriu que um queijo contendo uma mistura de bactérias probióticas diminuiu a contagem salivar de C. albicans
em um estudo controlado randomizado entre os idosos.
O objetivo do presente estudo foi investigar a capacidade de uma selecção das estirpes de lactobacilos, utilizados em produtos probióticos disponíveis comercialmente, para inibir o crescimento de Streptococcus mutans e C. albicans in vitro
. A hipótese nula testada foi de que nenhuma das cepas de lactobacilos fosse significativamente diferente do outro.
Métodos
cepas de lactobacilos e cultivo
Oito cepas de lactobacilos probióticos (L. plantarum
299v, L. plantarum
931, L. rhamnosus GG
ATCC 53103, L. rhamnosus
LB21, L. paracasei
F19 e L. reuteri
PTA 5289, L. reuteri
ATCC 55730 e L. acidophilus
La5) usado em diferentes produtos probióticos foram seleccionados (Tabela 1). As bactérias foram fornecidas pelos diferentes produtores em formas puras (suspensões ou liofilizado congelados), exceto para L. acidophilus
La5 que foi isolado de A-fil ® (Arla Ltd, Estocolmo, Suécia). As cepas foram caracterizadas pelo sistema API CH 50 (BioMérieux ® SA, Marcy-l 'Etoile, França) para confirmar sua identidade. As bactérias foram inicialmente cultivados durante 16-20 h em agar MRS (de Man, Rogosa, Sharpe, Oxid, Hampshire, Inglaterra). Uma colónia distinta de cada bactéria foi então transferido para 4,5 ml de caldo MRS para mais de 16-20 h de incubation.Table 1 probióticos cepas de lactobacilos, produtor e produtos utilizados nas experiências atuais.
Esforços
Produtor
Produto
L. plantarum
299v
Probi AB, Lund, Suécia
Fruit beber
L. plantarum
931
Essum, Umeå, na Suécia
Fruit beber
L. rhamnosus GG
ATCC 53103
Valio Ltd, Helsinki, Finlândia
Yogurt
L. rhamnosus
LB21
Essum, Umeå, na Suécia
Yogurt
L. paracasei
F19
Arla Ltd, Estocolmo, Suécia
Iogurte, Mingau, Gruel
L. reuteri
PTA 5289
BioGaia, Estocolmo, Suécia
Gomas de mascar, comprimidos
L. reuteri
ATCC 55730
BioGaia, Estocolmo, Suécia
Gomas de mascar, Gruel, gotas, comprimidos
L. acidophilus
La5
Arla Ltd, Estocolmo, Suécia
Leite fermentado
mutans streptococci, cepas de Candida e cultivo
Cinco estirpes de estreptococos mutans ( MS), incluindo ambas as cepas de referência de laboratório (S. mutans
NCTC 10449, S. mutans
Ingbritt e S. sobrinus
OMZ176) e clínicos isolados (S. mutans
P1: 27 e S. mutans
P2: 29) foram cultivadas em placas de agar de sangue (Columbia sangue Agar Base, alfa Bioscience, Baltimore, EUA) suplementado com sangue de cavalo a 5% durante 16-20 horas e no dia seguinte, as colónias puras de cada bactéria eram transferidas para 2 mL de caldo Todd-Hewitt (Oxid, Hampshire, Inglaterra) e incubadas durante mais 16-20 horas. Cinco cepas de Candida albicans
incluindo ambas as estirpes de referência (C. albicans
ATCC 28366, C. albicans
ATCC 10231) e isolados clínicos (C. albicans
1957, C. albicans
3339 e C. albicans
GDM8) foram cultivadas em Difco ™ Sabouraud Agar de maltose (Becton, Dickinson and complany, Sparks, EUA) durante a noite e no dia seguinte, as colónias puras de cada um de levedura foram transferidos para 2 ml Difco ™ Sabouraud caldo maltose e incubou-se durante 16-20 horas. Os C. albicans
linhagens foram caracterizadas pela API Candida (BioMérieux ® SA, Marcy-l'Etoile, França). Cultura de lactobacilos e estreptococos mutans foram realizadas em atmosfera anaeróbica (10% de H2, 5% de CO2 e 85% de N2) numa câmara anaeróbica a 37 ° C, enquanto que a cultura de C. albicans
foi realizada sob condições aeróbicas a 37 ° C.
Agar testes de interferência sobreposição
As culturas em caldo de lactobacilos foram diluídos em série em passos de dez vezes. A densidade óptica (OD) foi medida a 630 nm utilizando um espectrofotómetro a diluição 10 -1 (Ultrospec 100 Pro, Espectrofotómetro visível, Biochrom Ltd. em Cambridge, Inglaterra). As suspensões de células não diluídas e de suspensão correspondentes a aproximadamente 10 9, 10 7, 10 5, e 10 3 CFU /ml foram usadas nas experiências de inibição. Um ml de cada suspensão de lactobacilos foi adicionado em 24 ml de agar MRS estéril fundido (ca 45 ° C) e as placas foram fundidos. Quando o agar foi definido, as placas foram incubadas a 37 ° C durante a noite em atmosfera anaeróbica. No dia seguinte, uma segunda camada de agar de 23 ml de agar molted M17 suplementado com 10% de lactose estéril filtrado (May and Baker, Dagenham, Inglaterra) foi fundido na parte superior do ágar MRS com lactobacilos crescida. As placas foram deixadas a secar durante 3 horas à temperatura ambiente. culturas de caldo de MS cultivados durante 16-20 horas em caldo Todd-Hewitt foram diluídas no mesmo meio e o OD foi medida a 500 nm e ajustada para 0,2. As suspensões de MS foram estampadas nas placas com replicador de Steer (CMI-Promex ICN, Pedricktown, EUA). As placas foram deixadas à temperatura ambiente durante 1 hora para secar e foram subsequentemente incubadas durante a noite a 37 ° C na câmara anaeróbica. Para testar a susceptibilidade de C. albicans
, 24 ml Difco ™ Sabouraud Agar de maltose (ORS) foi fundido na parte superior do ágar MRS com lactobacilos crescida. culturas de caldo de C. albicans
cultivados durante 16-20 h em Difco ™ Sabouraud Maltose Caldo foram diluídas no mesmo meio e o OD foi medida a 500 nm e ajustada para 0,2. As suspensões foram então estampadas sobre as placas da mesma forma como o MS (ver acima). As placas inoculadas com C. albicans
foram incubadas em ar a 37 ° C. Como controles, os albicans MS e C.
estirpes foram estampadas em placas de agar sem lactobacilos dentro da primeira camada de agar.
Todos os ensaios foram realizados em duplicado e cada experimento foi repetido em três ocasiões diferentes. Os resultados dos ensaios de difusão em agar foram classificados da seguinte forma de acordo com Simark-Mattsson et ai. [17]: Pontuação 0 = inibição completa (sem colónias visíveis), Pontuação 1 = ligeira inibição (pelo menos uma colónia visível mas quantidades definitivamente menores, em seguida, na placa de controle) e Pontuação 2 = nenhuma inibição (o mesmo crescimento como na placa de controle). A avaliação das placas foi realizada por dois observadores independentes, em caso de desacordo um consenso foi alcançado depois da discussão.
De pH medições
Como uma estimativa da produção de ácido lactobacilos, o pH da superfície das placas com MRS M17 e SAB agar foi determinada antes e depois da incubação final de cada estirpe de lactobacilos mas sem estreptococos mutans ou candida. Um método
Estatística medidor de pH (Seven Easy pH, Mettler-Toledoo GmbH, Schwerzenbach, Suíça) equipado com um eléctrodo plano foi usado e a média das duas medidas foi calculado.
Os dados foram processados com o software SPSS (versão 17.0, Chicago Ill, EUA) e submetido a testes de qui-quadrado. Um valor de p & lt; 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Resultados Caracterização de lactobacilos e Candida albicans
Ambos L. plantarum
estirpes, bem como o acidophilus L.
La5, L. paracasei
F19 estirpes foram identificados pelo sistema API 50 CH sem dificuldade. As duas estirpes de L. reuteri
deu um perfil bioquímico interpretado como L. fermentum
. Nenhuma das estirpes de L. rhamnosus
foram totalmente identificados pelo sistema. Todas as cinco estirpes de Cândida foi completamente identificada como C. albicans
pelo ensaio de Candida API.
Inibição do crescimento de Streptococcus mutans
Os resultados do ensaio de inibição do crescimento encontram-se resumidos na Tabela 2. Em concentrações que variam a partir de 10 < sup> 9-10 5 CFU /ml, todas as estirpes de lactobacilos inibiu o crescimento das estirpes MS completamente com a excepção de L. acidophilus
La5 que executado apenas uma ligeira inibição de algumas estirpes em concentrações correspondentes a 10 < sup> 7 e 10 5 CFU /ml. L. acidophilus
La5 tinha uma capacidade de inibição estatisticamente significativamente mais fraca em comparação com as outras estirpes probióticas (p & lt; 0,05). Na concentração de células menor (10 3 UFC /mL), apenas L. plantarum
299v e L. plantarum
931 exibido uma inibição total de crescimento enquanto que uma ligeira inibição foi observada para todas as cinco estirpes MS por L . rhamnosus
LB21, L. paracasei
F19, L. reuteri
PTA 5289 e L. reuteri
ATCC 55730. L. rhamnosus GG
ATCC 53103 diluído a 10 3 UFC /mL inibiu o crescimento ligeiramente para três das cinco estirpes MS (S. mutans NCTC 10449
, S. sobrinus OMZ176
mutans e S.
P1: 27), enquanto que baixas concentrações de L. acidophilus
La5 não afetou o crescimento MS. Em geral, não foram observadas diferenças significativas na inibição do crescimento entre as cepas de referência e da isolates.Table 2 inibição via oral Crescimento de mutans estirpes de estreptococos por lactobacilos probióticos selecionados em concentrações diferentes de células.
< col>
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grupo mutans (inibição score)
Lactobacilli
CFU/ml
Ingbritt
NCTC
10449
OMZ176
P1:27
P2:29
L. plantarum 299v
103-109
0
0
0
0
0
L. plantarum
931
103-109
0
0
0
0
0
L. rhamnosus GG
105-109
0
0
0
0
0
ATCC 53103
103
0
1
1
1
0
L. rhamnosus
105-109
0
0
0
0
0
LB21
103
1
1
1
1
1
L. paracasei
105-109
0
0
0
0
0
F19
103
1
1
1
1
1
L. reuteri
105-109
0
0
0
0
0
PTA5289
103
1
1
1
1
1
L. reuteri
105-109
0
0
0
0
0
ATCC 55730
103
1
1
1
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