Abstract
Fundo
implantes de titânio na cavidade oral são cobertos com uma película derivados de saliva para que colonizar início de microorganismos tais como Streptococcus oralis
pode vincular. Os perfis de proteínas de películas salivares sobre o titânio não foram bem caracterizados e as proteínas de importância para a ligação são, portanto, desconhecido. bactérias biofilme exibem fenótipos diferentes das suas contrapartes planctónicos e contactar com as proteínas salivares pode ser um factor que contribui para a indução de alterações na fisiologia. Temos caracterizado películas salivares de superfícies de titânio e investigou como o contacto com superfícies de titânio revestidos e não revestidos com saliva afeta a atividade metabólica em células aderentes de S
. oralis
.
Métodos
películas salivares sobre superfícies de titânio liso e estas foram dessorvidas, bem como saliva humana purificada, foram submetidos a electroforese em gel bidimensional e espectrometria de massa. Um modelo de célula de fluxo de prato paralelo foi utilizado para estudar a ligação de um isolado de fresco de S
. oralis
de superfícies de titânio não revestidas e revestidas com saliva. atividade metabólica foi avaliada usando o Bac
microscopia de luz laser CTC Kit vitalidade e confocal. Os experimentos foram realizados em triplicado e os resultados analisados utilizando t de Student
-teste ou ANOVA.
Resultados da IgA secretório, α-amilase e cistatinas foram identificadas proteínas como dominantes nas películas salivares. adsorção selectiva de proteínas foi demonstrada pelo enriquecimento de proteína indutível prolactina e na ausência de zinco-α
em relação à saliva 2-glicoproteína. A adesão da S
. oralis
de titânio levou a um aumento da regulação da actividade metabólica na população após 2 horas. Na presença de uma película salivar, este efeito foi aumentado e sustentado ao longo do período seguinte de 22 horas.
Conclusões
Mostrámos que a adesão a superfícies lisas de titânio sob fluxo faz com que uma sobre-regulação de actividade metabólica no início colonizador S orais
. oralis
, provavelmente como parte de uma adaptação ao modo de biofilme de vida. O efeito foi reforçada por uma película salivar contendo slgA, α-amilase, cistatinas e prolactina proteína indutível que foi, pela primeira vez, identificada como um componente abundante de películas salivares em titânio. Mais estudos são necessários para esclarecer os mecanismos subjacentes ao efeito de superfície de contato sobre a atividade metabólica, bem como para identificar as proteínas salivares responsáveis para aumentar o efeito.
Palavras-chave
Bactérias microbiana biofilme dental Implant estreptococos eletrônico material suplementar
a versão online deste artigo (doi:. 10 1186 /1472-6831-13-32) contém material suplementar, que está disponível para usuários autorizados
Fundo
a cavidade oral humana abriga um grande número de. espécies de bactérias diferentes, que se encontram em complexos, os biofilmes multi-espécies. Nos dentes, estes biofilmes são comumente conhecido como placa bacteriana. Crítica para a formação e desenvolvimento da placa é a adesão de espécies pioneiras, tais como Streptococcus oralis
, Streptococcus mitis Comprar e Streptococcus gordonii
, bem como Actinomyces naeslundii
à película salivar que reveste a superfície do dente [1, 2]. Uma vez que a formação de biofilme foi inicializado e a superfície do dente nascente é colonizado, co-adesão dos colonizadores posteriores leva à formação de biofilmes orais maduras [3]. O desenvolvimento precoce de biofilmes em implantes dentários não tem sido bem estabelecida, mas a sequência da colonização microbiana é pensado para ser semelhante ao usado para os dentes da mesma cavidade oral [4, 5].
Dentes e implantes dentários, bem como as superfícies das mucosas, são cobertas com uma película que é uma película fina de proteínas adsorvidas derivado principalmente a partir da saliva. proteínas de película proporcionam uma variedade de receptores potenciais para a fixação dos colonizadores iniciais. Uma combinação de
in vivo e in vitro
estudos utilizando abordagens baseadas em anticorpos e proteómica, mostrou que a película de esmalte adquirida contém uma variedade de diferentes proteínas salivares incluindo lisozima, histatinas, statherins [6], α-amilase , cistatinas, IgA secretora (slgA), lactoferrina e proteínas ricas em prolina (PPR) [7], bem como o grande mucina salivar, MUC5B [8]. Para um resumo abrangente de proteínas detectadas em películas de esmalte ver Siqueira et al
., 2012 [9]. A composição de uma película aderente, bem como a densidade e a conformação das proteínas presentes na mesma, é geralmente pensado para ser influenciada pelas propriedades físico-químicas do substrato mas, ainda assim, a composição total das películas salivares formada sobre superfícies de titânio diferentemente modificados são desconhecidos. Apesar da existência de apenas alguns estudos, algumas proteínas salivares incluindo, cistatinas slgA, α-amilase e proteínas ricas em prolina têm sido identificados na película aderente formado em titânio
in vitro utilizando transferência de Western [10, 11]. No entanto, em todos estes estudos, os métodos utilizados para preparar a saliva para utilização como uma película pode ter um grande impacto sobre os resultados obtidos. Por exemplo, de filtragem e de centrifugação técnicas pode remover grandes populações de proteínas salivares que conduzem à formação de películas salivares que não são representativos dos presentes in vivo
.
O reconhecimento de que os biofilmes microbianos são um factor importante associado com a insuficiência dos implantes dentários [12] levou a muitas investigações sobre a adesão bacteriana a superfícies de titânio. In vivo
, onde a aderência de bactérias e a formação de película salivar ocorrer em paralelo, S
. oralis Comprar e S
. mitis
estavam entre os colonizadores iniciais predominantes em superfícies de vidro revestido de titânio e não Actinomyces
espécies foram encontradas [13]. In vitro
, a presença de saliva em ambas as superfícies lisas ou ásperas moderadamente tem sido demonstrado que tanto aumentar como diminuir a aderência do colonizador precoce, S
. oralis
, [10, 14], enquanto a ligação de um
. naeslundii
de titânio não foi afectada pela presença de uma película salivar [11]. No geral, os resultados de estudos de aderência bacteriana ao titânio na presença de saliva, não produziram uma imagem clara e enquanto algumas das diferenças observadas podem atribuível à saliva utilizada, a variação nas estirpes bacterianas e tipos de superfície de titânio também pode contribuir para a falta de consenso.
Embora o desenvolvimento de biofilme é importante para o desenvolvimento de doenças orais, um factor crucial é a fisiologia e o nível de actividade das bactérias aderidas. adaptação bacteriana para o modo de biofilme de vida é conhecida por estar associada com importantes alterações na transcrição e a síntese de proteínas [15]. Por exemplo, em Porphyromonas gingivalis
análise comparativa do transcriptoma revelou que um grande número de genes são expressos diferencialmente em células do biofilme em comparação com as suas contrapartes de flutuação livre [16]. Num estudo em Streptococcus mutans
, a taxa relativa de síntese de pelo menos 25 proteínas diferentes foi reforçada dentro de 2 horas de fixação a uma superfície de vidro. Estas proteínas foram maioritariamente associados a hidratos de carbono catabolismo [17] o que sugere que as alterações na actividade metabólica pode ocorrer durante a adesão a superfícies. Pouco se sabe, no entanto, sobre o estado metabólico das células durante interacções com proteínas película nas fases iniciais da formação do biofilme. O objetivo deste trabalho foi estudar como a adesão a superfícies de titânio afeta a atividade metabólica do início do colonizador S
. oralis
e para determinar o efeito de uma película salivar sobre este processo. Para lançar luz sobre o qual as proteínas salivares podem influenciar a aderência e actividade metabólica, as proteínas predominantes presentes em uma película salivar formados em titânio foram identificados.
Métodos
bactérias e as condições de cultura
um isolado clico fresco de S
. oralis
(89C) foi obtido a partir de um paciente com uma infecção em curso peri-implante após homologação ética tinha sido obtido a partir da Faculdade de Odontologia [14]. As bactérias foram crescidas durante a noite em agar de sangue numa atmosfera de 5% de CO 2 no ar a 37 ° C. As colónias foram suspensos em 120 ml de solução salina tamponada com fosfato [NaCl a 0,15 M, 10 mM de NaH 2 PO? 4, pH 7,4 (PBS)] para se obter um OD 600 nm = 0,6. Para as experiências com células de fluxo, foi adicionado um volume igual de PBS para reduzir a metade a concentração de células antes da formação de biofilme, ao passo que para as experiências planctônicas a suspensão bacteriana original foi misturado com um volume igual de PBS, ou toda 50% saliva humana para dar uma concentração final de 25% de saliva.
Recolha e preparação de saliva
saliva total coletado em gelo ao longo de 1 hora a partir de dez indivíduos saudáveis foi reunido e preparada como descrito anteriormente [18] após a homologação ética tinha sido obtido a partir da Faculdade de Odontologia. Resumidamente, a amostra foi misturada com um volume igual de PBS, agitou-se suavemente durante a noite a 4 ° C e centrifugou-se numa centrífuga Beckman Coulter Avanti JE (Beckman JA 20 do rotor; Beckman Coulter, Brea, CA) (20 minutos, 30 000 g
, 4 ° C). O sobrenadante foi então sujeita a centrifugação isopícnica em gradiente de densidade em CsCl /NaCl 0,1 M num Beckman Coulter Optima LE-80K Ultracentrífuga (rotor Beckman Ti 50.2, a partir da densidade 1,45 g ml -1) a 36000 rpm durante 90 horas a 15 ° C. As fracções contendo bactérias foram descartados e os restantes foram reunidas, dialisadas contra PBS e armazenadas a -. 20 ° C
superfícies de titânio
As superfícies de titânio usados neste estudo eram de titânio comercialmente puro de grau IV, que era lisa, com uma rugosidade média da superfície (S a) de 0,1? M [14]. As placas (99 × 25 × 0,8 mm) foram transformadas, limpo com detergente, enxaguado com água destilada e esterilizada utilizando irradiação γ (ELOS Pinol A /S).
Caracterização de películas de saliva of Two placas de titânio, separados por um espaçador de borracha com uma espessura de 1,6 mm, foram montadas numa célula de fluxo e as superfícies revestidas com 50% durante a noite a saliva humana inteira. Após este tempo, as células de fluxo foram drenados e as superfícies lavadas (2 x 2 minutos) com PBS numa placa de balanço. Para remover as películas de superfície associada, uma mistura de Tween 80 (0,006% v /v) e Triton X-100 (0,012% v /v) foi introduzida e toda a célula de fluxo colocado num banho de ultra-sons durante 1 hora. O conteúdo foi então escorrida e recolhidas antes de repetir este passo por mais 15 minutos. desorbates proteína recolhidas após cada lavagem foram reunidas e a concentração de proteína determinada usando um kit de 2D Quant (GE Healthcare Life Sciences). Um volume correspondente a 20 ug de proteína foi sujeito a 2DE. Resumidamente, o desorbate foi diluída com tampão de reidratação e colocado numa cassete de inchaço re-com 18 centímetros de pH 4-7 tiras IPG lineares (GE Healthcare Life Sciences) em cima. A re-hidratação foi realizada à temperatura ambiente durante 30 horas sob óleo de silicone. A focagem isoeléctrica foi realizada utilizando um Multiphor II (GE Healthcare Life Sciences) com água de arrefecimento a 15 ° C fornecido por Pharmacia MultiTemp II. O concentrando foi iniciada com 150 V durante 1 hora e mantida a 300 V durante 3 horas, a 600 V durante 3 horas, a 1200 V durante 12 horas e, finalmente, 3500 V durante 20 horas. Depois de se concentrar, as tiras de IPG foram armazenadas a -80 ° C. Antes de executar na segunda dimensão, as tiras de IPG foram equilibradas pela primeira vez em Tris 50 mM, pH 6,8 contendo 2% de SDS, 26% de glicerol e DTT 16 mM durante 15 minutos e, em seguida, em 50 mM de Tris pH 6,8 contendo 2% de SDS, 26 % de glicerol, 250 mM de iodoacetamida e 0,005% de azul de bromofenol mais 15 minutos. As tiras de IPG foram equilibradas encaixado no topo de geles de poliacrilamida a 14% (20 x 20 x 0,1 cm) utilizando 0,5% (w /v) de agarose fundida. SDS-PAGE foi realizada a uma corrente constante de 15 mA gel -1, 10 ° C, durante a noite em uma cela xi PROTEAN II (Bio-Rad) com os padrões de massa molecular do arco-íris de alta gama (GE Healthcare Life Sciences) run no lado ácida das tiras de IPG. Os géis foram corados com azul brilhante de Coomassie ou com prata de acordo com os protocolos de GE Healthcare Life Sciences.
Identificação de proteínas em gel de 2D por LC-MS /MS
manchas de interesse foram excisadas manualmente a partir de géis de Coomassie 2DE coradas de azul brilhante de saliva total e sujeita a LC-MS /MS como descrito anteriormente [19]. Resumidamente, as proteínas foram reduzidas com DTT (a 60 ° C, 20 minutos), alquilados com iodoacetamida (25 ° C, 10 minutos) e depois digerida com tripsina (37 ° C, 8 horas). peptídeos trípticos foram separadas e submetido a MS. picos de peptídeos foram deconvoluídos automática e listas de massa em forma de mascote arquivos genérico usado como entrada para Mascot MS /MS íons pesquisas de banco de dados NCBInr usando o servidor web Matrix Science (http:.. //www matrixscience com) .
Determinação da cobertura de superfície e viabilidade
viabilidade das células em suspensão em PBS ou toda 25% de saliva foi avaliada por coloração de uma gota da suspensão com o vivo /morto Bac
kit de coloração de luz (Life Technologies, Estocolmo , Suécia) na linha de base (tempo 0), após 2 horas e 24 horas e a visualização com um varrimento a laser confocal de microscópio invertido (CSLM) (Eclipse TE2000, Nikon Corp.). O sistema de célula de fluxo chapa vertical, paralelo utilizado foi descrito anteriormente (14). Resumidamente, S
. oralis
células foram passadas mais de duas superfícies de titânio (99,25 x 25,25 x 0,8 mm) separadas por um espaçador de borracha 1,6 mm, que foram ou não revestido ou tinham sido revestidas com saliva durante a noite. Todas as experiências foram realizadas a 37 ° C e um fluxo laminar de 42 ml h -1 foi usada para modelar o fluxo de saliva por dia sobre as superfícies orais. Todas as soluções foram introduzidas através da entrada e saída inferior ocorreu através da válvula superior. Inicialmente, as superfícies foram lavadas com PBS durante 30 minutos. A mesma suspensão bacteriana foi então introduzida em duas células de fluxo; um contendo duas superfícies não revestidas e as outras duas superfícies revestidas com saliva contendo de 2 ou 24 horas a 37 ° C. Após este tempo, as células de fluxo foram lavadas com PBS (como acima) durante 30 minutos para remover as bactérias frouxamente ligados a partir das superfícies. Cobertura de superfície e a viabilidade das células associada de superfície foram avaliadas sobre uma das placas de titânio em cada célula de fluxo utilizando o Live /Dead Bac
coloração leve. As experiências foram realizadas três vezes, utilizando culturas bacterianas independentes.
Determinação da actividade metabólica
Para investigar a actividade metabólica de células planctônicas, uma alíquota foi removida a partir da mesma suspensão bacteriana utilizada para as medições de viabilidade, colocado num fluxo-Ibidi câmara da célula e as células incubadas com o Bac
Kit de luz vitalidade CTC (Life Technologies, Estocolmo, Suécia) numa câmara húmida a 37 ° C durante 2 horas. As lâminas foram então visualizadas utilizando um CSLM. Para investigar a actividade metabólica de células aderidas, a segunda placa de titânio em cada célula de fluxo, foi incubada com o Kit de vitalidade Bac
luz CTC como acima e, em seguida, as células contrastadas com 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole ( DAPI, Life Technologies, Estocolmo, Suécia). As células coradas foram visualizadas usando um CSLM. análise de Imagem Editorial e estatísticas Compra de amostras coradas com o Live /Morto Bac
kit de coloração clara, dez imagens aleatórias, cada um com uma área de 127,3 mm 2 foram tomadas por análise de imagem. As imagens foram analisadas usando o
_L
pacote de software BioImage para quantificar a cobertura média da superfície, bem como a proporção de células mortas (vermelho) [20] ao vivo (verde) e. Para as amostras coradas com o kit Bac
Vitalidade CTC luz para avaliar a actividade metabólica, foi realizada análise de imagem por meio da observação, pelo menos, 1000 células e contagem do número de células metabolicamente activas (vermelho /rosa) e células não-activos (não corada na amostras de suspensão ou azul contrastadas sobre as superfícies de titânio). Os resultados obtidos foram avaliados utilizando
-test t de Student para comparar dois grupos ou um one-way ANOVA com pós-teste de Bonferroni para comparar três grupos. Um intervalo de confiança de 95% foi escolhido e os valores de p menores que 0,05 foram considerados significativos.
Resultados da formação de biofilme em titânio em células de fluxo
a capacidade de formação de biofilme de S
. oralis
foi investigada em um sistema de células de fluxo contendo duas superfícies de titânio não revestidas. As colónias bacterianas dispersos em PBS foram introduzidos em culas de fluxo e deixou-se aderir durante 2 ou 24 horas. Após 24 horas, a cobertura de superfície média foi reduzida em 60% em relação ao que, após 2 horas, o que sugere que algumas das células que aderiram inicialmente isoladas ao longo do tempo (Figura 1). Na suspensão de células inicial do nível de viabilidade foi elevado, conforme revelado pela coloração com o Bac
luz vivo /morto kit. Depois de 2 e 24 horas, a viabilidade das populações aderentes não era significativamente diferente da da suspensão inicial, indicando que a ligação de titânio não afectou adversamente as células. Uma vez que as superfícies da cavidade oral são cobertas com uma película salivar, foi investigado o efeito da saliva na aderência e viabilidade de S
. oralis
. Em superfícies revestidas com 25% de saliva, a cobertura de superfície média após 2 horas (178 ± 103 pM 2) não foi significativamente diferente ao observado nas superfícies não revestidas (p = 0,67) (dados não mostrados). Como para as superfícies não revestidas, após 24 horas, a cobertura de superfície média no revestimento saliva tinha declinado (24,6 ± 7,4 ^ M 2), demonstrando que as células bacterianas também isolada a partir dessas superfícies ao longo do tempo. O grau de viabilidade das células na superfície revestida com a saliva não foi significativamente diferente daquela sobre a superfície não revestida, ao mesmo ponto de tempo. Figura 1 Imagens que mostram a formação de biofilme por S. oralis sobre superfícies de titânio não revestidos. As bactérias foram suspensas em PBS deixa-se formar biofilmes em superfícies de titânio num sistema de célula de fluxo de placas paralelas de 2 e 24 horas. A viabilidade das células foi avaliada por Dead Bac
coloração Live /luz e visualização com CSLM. cobertura de superfície nas placas de titânio foi avaliada a partir de dez imagens aleatórias usando o BioImage
_L
pacote de software. As barras de escala representam 10 mm e as inserções mostram células em dupla alargamento.
Atividade metabólica em relação ao contato com superfícies não revestidas e revestidas de saliva
atividade metabólica do S
. oralis
células foi avaliada usando o Bac
Kit Vitalidade Luz CTC, onde as células metabolicamente ativas reduzir o sal de tetrazólio incolor a um produto formazan insolúvel fazendo com que eles aparecem em vermelho (ou rosa na presença do counterstain DAPI azul). As células removidas de agar de sangue no tempo 0 e dispersos em PBS apresentaram um baixo nível de actividade metabólica endógena (6 ± 1,5%) (Figura 2). a incubação continuou das células em PBS teve nenhum efeito significativo sobre o nível de actividade metabólica depois de 2 horas (4 ± 0,5%) ou 24 horas (2 ± 0,1%). No entanto, depois de 2 horas no modelo de célula de fluxo, a população aderente continha uma proporção significativamente mais elevada de glóbulos vermelhos, indicando que a actividade metabólica foi estimulada pelo contacto com uma superfície. Após 24 horas, o nível de actividade metabólica no seio da população aderente tinha diminuído, mas era ainda significativamente maior do que na suspensão inicial de PBS (P & lt; 0,01). Figura 2 Imagens que mostram a atividade metabólica de S. oralis em suspensão e adere a superfícies de titânio não revestidos. As bactérias foram suspensas em PBS deixa-se formar biofilmes em superfícies de titânio num sistema de célula de fluxo de placas paralelas de 2 e 24 horas. A atividade metabólica das células foi avaliada usando o Bac
Kit Vitalidade Luz CTC. Para células aderidas, DAPI foi utilizado como um corante de contraste. As células foram vistos com células avaliadas pela contagem manualmente, pelo menos, 1000 células CSLM ea proporção de metabolicamente ativo (vermelho /rosa). As barras de escala representam 10 um e as inserções mostram células em dupla alargamento.
Os efeitos de revestimento saliva sobre a actividade metabólica das bactérias aderentes foram então investigados. Este revelou que os níveis eram significativamente maiores para as células associadas com a superfície revestida de saliva após 2 horas e 24 horas em comparação com aqueles na suspensão inicial de PBS (P & lt; 0,001) (Figura 3). A incubação de bactérias com 25% de saliva em suspensão não provocou alteração significativa na actividade metabólica durante 2 horas (4 ± 0,5%) ou 24 horas (3 ± 0,6%), sugerindo que o efeito era específico para as proteínas salivares aderido a uma superfície. Estes dados mostram, assim, que adsorvidos proteínas salivares têm a capacidade de induzir uma resposta metabólica, que não é visto quando as proteínas estão presentes em solução. A Figura 3 Imagens que mostram actividade metabólica de S. oralis aderidas às superfícies de titânio revestido de saliva. As bactérias foram suspensas em PBS permitido para formar biofilmes de superfícies de titânio revestido de saliva em um sistema de célula de fluxo de placas paralelas de 2 e 24 horas. A actividade metabólica das células foi avaliada utilizando o kit Bac
Vitalidade Luz CTC com DAPI como um corante de contraste. As células foram vistos com células avaliadas pela contagem manualmente, pelo menos, 1000 células CSLM ea proporção de metabolicamente ativo (vermelho /rosa). As barras de escala representam 10 um e as inserções mostram células em dupla alargamento.
Vez que as células não viáveis nas superfícies não são esperados para mostrar a actividade metabólica, para investigar o nível de actividade metabólica como uma função do número de células viáveis , numa proporção foi calculada para cada ponto de tempo (Tabela 1). Este revelou que para as células em suspensão em PBS ou saliva, enquanto que a viabilidade foi mantida, não houve alterações significativas na actividade metabólica ao longo do tempo. A adesão a uma superfície não revestida causou a percentagem das células viáveis que estavam metabolicamente activa a subir para 50% após 2 horas, enquanto que a ligação a uma película de saliva aumentou significativamente este nível de 98% de células viáveis (p & lt; 0,001). Assim, enquanto o contacto inicial com uma superfície causaram um aumento na actividade metabólica dentro da população, esta foi grandemente aumentada pela presença de uma película salivar. Após 24 horas, a percentagem de células metabolicamente activas na superfície de titânio não revestido tinha decrescido para 25%, enquanto que na superfície revestida de saliva o nível manteve-se em 96%. Isto sugere que, para além de aumentar a resposta inicial à superfície de contacto, a presença de proteínas salivares sustentada o aumento da actividade metabólica sobre 24 hours.Table 1 Proporção de bactérias viáveis na população que mostra a actividade metabólica, sob diferentes condições
Ambiente
% de células vivas com atividade metabólica
0 h
2 h
24 h
células suspensas em PBS
6 ± 1,5
4 ± 0,5
2 ± 0,03
células aderidas a superfícies não revestidas em PBS
Restaurant -
50 ± 4,5
25 ± 2,6
células suspensas em 25% saliva
-
4 ± 0,8
3 ± 0,6
células aderidas a superfícies revestidas com 25% saliva
-
98 ± 4,3
96 ± 6,3
Caracterização de revestimento saliva sobre superfícies de titânio
para identificar os componentes principais de proteína na preparação de saliva livre de bactérias, o material foi submetido a 2DE proteínas e visualizadas por coloração com azul brilhante de Coomassie (Figura 4a). Este revelou a presença de mais de 100 pontos, dos quais a maioria (70) foram colhidos, e 68 destes poderia ser identificado utilizando LC-MS /MS (Tabela 2). Quase todas as proteínas presentes mostraram ser de origem salivar, com IgA secretora, zinco-α 2-glicoproteína, os membros da família cistatina, α-amilase e da proteína induzida por prolactina (PIP), como as espécies dominantes no preparação. Além disso, a calicreína, a proteína de ligação de ácidos gordos e de proteínas de von Ebner foram identificados. Figura 4 2DE géis de saliva completa e a película salivar dessorvida a partir de superfícies de titânio. Reunidas saliva total humana (A) e películas salivares dessorvidas a partir de superfícies de titânio com detergente (B) foram submetidos a isoeléctrico centrando-se sobre tiras de IPG pH 4-7 seguido de SDS-PAGE em 14% de gel. Os géis foram corados com Azul de Coomassie (A) ou prata (B). Manchas de interesse foram colhidos a partir do gel com Coomassie, identificado utilizando LC-MS /MS e detectar identidades transferidos para o gel de prata. Uma explicação dos rótulos é dada na Tabela 2. Tabela 2
Identidades de proteínas a partir de saliva completa ou películas salivares dessorvidas a partir de superfícies de titânio com detergente obtidos utilizando LC-MS /MS de manchas de geles de 2DE.
Identidade Proteína
nome do ponto
cobertura Sequence
%
detectado na superfície
amilase
amy
45- 55
Sim
calgranulina
cal
49
Sem
cistatina
S
cysS
77
Yes
SA
cysSA
37–73
Yes
D
cysD
31
Yes
proteína de ligação de ácidos graxos
fab
51
Sim
Imunoglobulina A
cadeia J
IgA /J
37-63
Sim
cadeia pesada
IgA /h
18- 36
Sim
região de cadeia pesada C
IgA /c
21
Sem
secretora component
sec
32–36
Yes
Bur
Bur
11–15
No
Imunoglobulina
cadeia leve (kappa)
Ig /κ
38-59
Sim
calicreína
kal
10
Sem
proteína prolactina-inducible
pip
63-67 proteína glândula
Sim
Von 's Ebners (lipocalina)
VEB
27
Sem
Zinc-α 2-glicoproteína
ZnGP
23-45
Sem
Para identificar as proteínas presentes no película salivar sobre titânio formado, as superfícies foram incubadas durante a noite com a saliva e, após a lavagem, as proteínas foram aderidas dessorvido com detergente e sujeitas a 2DE (Figura 4b). coloração de prata dos géis revelados em torno de 50 pontos dos quais todos foram vistos no gel corado com Coomassie saliva. A IgA secretora, proteínas de cistatina, α-amilase e PIP estavam presentes, mas de zinco-α 2-glicoproteína se encontra ausente, indicando que esta proteína não aderiu à superfície de titânio. A intensidade relativa de pontos PIP na película foi maior do que na preparação de saliva inicial sugerindo que esta proteína pode ser enriquecido na superfície de titânio.
Discussão
colonizadores iniciais, tais como S
. oralis
iniciar a formação de biofilme por interagir directamente com a película salivar, que está presente nas superfícies orais. Neste estudo, utilizou-se películas de saliva preparado por centrifugação em gradiente de densidade, sob condições não desnaturantes. A vantagem desta técnica é que as bactérias salivares, que são revestidas, podem ser separados a partir de macromoléculas grandes que permitem a preparação de saliva, livre de bactérias "nativa" em que mesmo grandes proteínas salivares estão presentes. Temos anteriormente identificados os dois grandes mucinas salivares (MUC5B e MUC7), bem como GP340, lisozima, lactoferrina, α-amilase, a IgA secretória e statherin em esta preparação utilizando ELISA [21]. Neste estudo, foi realizada 2DE em combinação com a LC-MS /MS para identificar proteínas salivares de peso molecular mais baixo (Figura 4A). A IgA secretora foi a proteína mais abundante como revelado pela presença de vários fragmentos (componente secretor, de cadeia pesada, de cadeia κ e de cadeia J). De acordo com análises de saliva humana por outros grupos, usando proteômica abordagens [7, 22] nós também foram capazes de identificar α-amilase, proteínas da família cistatina, zinco-α 2-glicoproteína e PIP. Ácido gordo de ligação às proteínas, a calicreína e da proteína da glândula de von Ebners (lipocalina) estavam presentes em quantidades menores. Neste estudo aplicou a metodologia para examinar as películas salivares formados em titânio. Isto mostrou que a sIgA e α-amilase foram as proteínas mais abundantes na película em adição aos membros da família de proteínas cistatina e PIP (Figura 4b). Estudos anteriores utilizando SDS-PAGE combinada com a análise de Western blot com anticorpos específicos contra as proteínas salivares, têm mostrado que α-amilase, e slgA PPRs se ligam ao titânio [10, 11]. Zinco-α 2-glicoproteína estava ausente da desorbate película o que sugere que esta proteína não adere ao titânio Considerando que a maior abundância relativa de PIP na desorbate do que na preparação de saliva inicial indica que a proteína é enriquecida na superfície. bactérias orais, tais como S
. salivarius
, S
. parasanguinis Comprar e S
. oralis
pode interagir com PIP [23, 24], o que sugere que esta proteína pode ter um papel importante na modulação da colonização bacteriana das superfícies orais. Para nosso conhecimento, esta é a primeira vez que PIP tem sido identificada como uma proteína abundante em películas de titânio. Uma proteína de 20 kDa correspondente ao PIP [25] tem sido demonstrado anteriormente para se ligar a hidroxiapatite, mas não foi enriquecida na mesma forma encontrada aqui [26]. Uma limitação deste estudo, porém, é que é atualmente desconhecido se os resultados são aplicáveis a outras superfícies de titânio com diferentes topografias de superfície ou modificações de superfície.
No modelo de célula de fluxo, S
. oralis
aderiu bem às superfícies revestidas de saliva após 2 horas - de acordo com outros estudos sobre colonizadores primários, tais como Streptococcus anginosus
, Streptococcus gordonii Comprar e Streptococcus sanguinis
[10] e Actinomyces naeslundii
[11]. Como um grupo, estreptococos orais são conhecidas por expressar adesinas que têm afinidade para uma gama de proteínas presentes na saliva [27]. Em um estudo anterior, identificamos, uma proteína LPXTG ligada ao amino-ácido contendo 1.060 expressa em estirpes de S
. oralis
que ligava bem com películas salivares e in silico
análise da S
. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.
