da arte abstracta
Fundo
O papel de glicoconjugados da superfície celular na mucosa bucal enxerto-versus-hospedeiro (GVHD) ainda não é clara, apesar de alterações moleculares no epitélio oral são essenciais para a patogénese das lesões. Neste estudo, nós investigamos as mudanças na ligação da manose (Man) Lens culinaris espec�ico
lectina (LCA) na mucosa oral de ratos com GVHD.
Métodos
células do baço de ratos Lewis foram injetadas ( Lewis x Brown Noruega) F
1 ratos para induzir GVHD sistémica, incluindo lesões da mucosa oral. amostras da língua e do baço foram avaliados utilizando histoquímica com lectinas, imunohistoquímica, Western blot, transpo� ensaios de migração e Stamper-Woodruff ensaios de ligação.
Resultados da ligação de Man-específica LCA expandido para as camadas epiteliais da língua em GVHD-ratos . Uma expansão do LCA ligação foi relacionado com o aumento da expressão de manosil-transferase na mucosa oral. CD8 + células, células efetoras da GVHD mucosa oral, expressa a proteína de ligação a manose (MBP) e migraram para o meio contendo Homem no ensaio de migração transpoço. A adesão das células CD8 + células do epitélio bucal pode ser inibida por pré-tratamento de CD8 + células com anticorpo MBP e /ou pelo pré-tratamento com secções específicas do Homem LCA.
Conclusões
aumento da expressão de Homem em queratinócitos leva para a migração e /ou adesão de CD8 + células na superfície do epitélio, que é mediada, em parte, pela via de PAM /Homem-ligação durante o desenvolvimento de GVHD da mucosa oral. Palavras-chave
enxerto contra o Lens doença do hospedeiro culinaris
lectina de proteína de ligação a manose CD8 + linfócitos material suplementar Electrónicas | A versão online deste artigo (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-5) contém complementar material, que está disponível para usuários autorizados.
Fundo
doença do enxerto contra hospedeiro (GVHD) é uma complicação que pode ocorrer após um transplante de medula com células-tronco hematopoiéticas ou osso, que as células do doador recém-transplantados atacar o transplante corpo do destinatário. GVHD é caracterizada por inflamação do epitélio selectivo que afecta os órgãos mucocutâneas, tracto gastrointestinal, fígado e [1]. Ambos os estudos clínicos e experimentais foram identificados mucosa oral como um dos locais críticos afectadas por GVDH [2, 3]. alterações histopatológicas no GVHD mucocutânea incluem satelitose, no qual os linfócitos formam aglomerados em torno disceratóticas e /ou queratinócitos necróticos (KCS). Os linfócitos, particularmente CD8 + células, migrar a partir do interstício perivascular na camada epitelial sobrejacente e induzir alterações degenerativas em KCs, sugerindo que a determinação da natureza da destruição KC pode ajudar na compreensão da patogenia da DECH mucocutânea [4]. Durante este processo, a expressão de moléculas específicas, tais como MHC de classe II e molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1), ocorre em epitelial KCs para interagir com as células efectoras [5-8]. Particularmente, um aumento da expressão de ICAM-1 em KCs conduz à migração de células efectoras no epitélio superficial, que é mediada, em parte, pela via de ICAM-1 /função linfocitária-antigénio-1 associado (LFA-1) [3].
o progresso recente na glicobiologia tem revelado que os glicoconjugados de superfície celular desempenham um papel essencial no reconhecimento de eventos. sondas de lectina têm sido tipicamente usados para detectar glicoconjugados de superfície celular, porque as lectinas são definidos como a ligação de hidratos de carbono diferentes de enzimas ou anticorpos (Abs) proteínas [9]. Eles estão envolvidos em diversos processos biológicos em muitas espécies, tais como a depuração de glicoproteínas do sistema circulatório, a adesão de agentes infecciosos para células hospedeiras, o recrutamento de leucócitos para locais inflamatórios, e as interacções das células no sistema imunitário, em conjunto com malignidades e metástase [ ,,,0],9]. ligação à lectina é modificado durante o processo de diferenciação epitelial e estimulação lesões da pele e mucosa oral [10-13]. Entre essas lectinas, Lens culinaris
lectina (ACV), conhecido como um ligante de manose (Man), possui especif icidades de ligação original, com um núcleo de 1,6-biantenal fucosilado oligossacáridos e glicanos de transferrina de soro humano e α-fetoproteína [ ,,,0],14]. superfície celular Homem é também um ligando para a proteína de ligação a manose (MBP), que funciona na opsonização dos microrganismos para os fagócitos e de célula mediada por actividade de citotoxicidade anti-tumor [14, 15]. Estes estudos conduziram à hipótese de que as alterações na expressão determinantes no Homem KCs vai ajudar na compreensão da patogénese de GVHD da mucosa oral. Nossa abordagem para esta premissa tem sido a de se concentrar na expressão Homem de superfície celular por KCs e sua interação com MBP em ratos mucosas GVHD oral dos ratos. O nosso estudo tinha três objectivos: (1) para determinar a expressão do homem da superfície celular por KCs usando ACV específicos do homem, (2) para investigar se CD8 +, células efectoras em GVHD mucosa oral, migrar para um homem contendo médio, e (3) para determinar se a expressão homem por KCs medeia a ligação de MBP-expressando CD8 + células para KCs. Os resultados indicam que, durante o desenvolvimento de GVHD da mucosa oral, em ratos, a expressão aumentada do homem pelo KCs leva para a migração e /ou a adesão de células T CD8 + células no epitélio superficial, mediada em parte pela MBP /homem de ligação pathway.
Métodos
Rats
fêmea adulta pura Lewis (LEW, RT1 l) e Lewis × Brown Norway F 1 híbrida (LBNF 1, a RTL 1 /n) ratos pesando 250 a 350 gramas foram adquiridos a partir de Kyudo Co. (Saga, Japão). Os estudos com animais foram conduzidos de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal de Fukuoka Dental College.
Indução de GVHD
baços removidos de ratos LEW foram dissecados em solução de Hanks, forçado através de um crivo de aço inoxidável, e filtrou-se através de uma malha de nylon (Filtros de células; BD Biosciences, CA, EUA). As células foram lavadas três vezes em solução de Hanks 'e ressuspensas a 10 8 /ml em meio RPMI-1640 com 10% de soro fetal de vitelo. A viabilidade celular foi determinada por análise de exclusão com azul de tripano. A GVHD foi induzida por uma injecção intraperitoneal de 3 ml de 3 x 10 8 células em LBNF 1 ratos. Não tratados LBNF 1 ratos e LBNF 1 ratos injetados com um número igual de LBNF singênica 1 esplenócitos foram utilizados como controle. Todos os ratos foram pesados diariamente e cuidadosamente observados para sinais clínicos de doença.
Avaliação de GVHD
Avaliação clínica da GVHD foi determinada pela perda de peso e ao desenvolvimento de eritema cutâneo ou mucoso, especialmente nas orelhas, mucosa nasal, pé -pads e lábios. Ambas as condições clínicas apareceu no dia 10 após a injecção e se tornou grave posteriormente. Um ensaio de peso do baço foi realizada na autópsia para confirmar a avaliação imunológica de GVHD. Após 10 dias, os ratos experimentais mostraram esplenomegalia notável como um sobre-expressão da resposta imunitária relacionada com a GVHD [16]. Todos os animais de controlo sobreviveram e pareciam saudáveis.
Preparação do tecido
A língua inteiro foi excisado 1-21 dias após a injecção de cinco animais em cada grupo de tratamento. Metade das amostras foram fixadas língua em paraformaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS). As secções de parafina (4 mm) foram então coradas com hematoxilina e eosina (H & amp; E) para examinar as alterações histopatológicas. A outra metade foi imediatamente congelado em nitrogênio líquido e cortes congelados de série foram utilizados para a imunocoloração, histoquímica com lectinas, e in vitro
ensaios de adesão.
Lectina histoquímica
LCA, Ulex europaeus
I (UEA- 1), e Archis
hypogaea (amendoim: PNA) foram usadas para a detecção de α-D-Man, α-L-fucose, galactose e β1,3galactosamine, respectivamente (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, EUA ). ACV ligação foi detectada utilizando o Alexa Fluor 568 - método de biotina estreptavidina marcada. secções congeladas fixadas em acetona foram incubadas com ACV biotinilado (25? g /ml; Vector Laboratories) durante 30 min e Alexa Fluor estreptavidina 568-marcado (1: 400; Molecular Probes, Eugene, OR, USA) durante 30 min à temperatura ambiente. controlos histoquímicos ACV não conjugado para o conjugado biotina-LCA e reacção com ACV biotinilado inactivado pelo seu inibidor açúcar específico substituído (D-manose, 2 mM; EY Laboratories, Inc., San Mateo, CA, EUA)
Imunohistoquímica Abs utilizadas neste estudo foram como se segue: (a) um anticorpo policlonal de coelho Ab contra ALG11, reactivo com manosiltransferase (1: 300; Novus Biologicals, Littleton, CO, EUA), (b) um anticorpo policlonal de coelho Ab contra LMAN2, reactivo com MBP 2 (1: 100; Aviva Biologia de Sistemas, San Diego, CA, EUA), (c) um anticorpo monoclonal de ratinho Ab contra 1A29, reactivo com ICAM-1 (1: 100; Cederlane Lab, Ontario, Canada.), e ( d) um Ab monoclonal de ratinho contra OX-8, reactivo com CD8 (1:. 100; Cederlane Lab). secções congeladas fixadas em acetona foram primeiro incubadas com soro de coelho normal para diminuir a ligação não específica e em seguida feito reagir com uma das Abs, durante a noite a 4 ° C. As secções foram então incubadas com conjugado com fosfatase alcalina anti-coelho ou Ab anti-ratinho Ab (1: 150 de diluição; DakoCytomation, Tóquio, Japão) durante 45 min à temperatura ambiente. reacções imuno-histoquímicos foram visualizadas utilizando 5-bromo-4-cloro-3-indolilo solução de cloreto de nitro azul de tetrazólio /fosfato (solução BCIP /NBT; DakoCytomation). Como um controlo, as secções foram tratadas com IgG de coelho normal em vez de o primeiro conjunto de Abs.
Western blotting
proteína total foi extraído a partir do baço e língua espécimes de ratos de controlo ou GVHD utilizando tampão de lise de células gelada (20 m m de Tris-HCl, pH 7,5; 150 mMNaCl; ácido etilenodiaminotetracético 1 mM [EDTA]; Na 1 mM de 2EDTA; ácido etileno-glicol-tetraacético 1 mM; 1% [v /v], Triton-X 100; de sódio 2,5 mM pirofosfato; 1 mMβ-glicerofosfato; 1 mM de Na 3VO 4; e 1 ug /mL de leupeptina e fluoreto de fenilmetilsulfonilo). Quantidades iguais de proteína (20 ug) foram separados por electroforese em gel de dodecilsulfato de sódio-sulfato de poliacrilamida (SDS-PAGE; 12% de gel de separação). Após a electroforese, as proteínas foram transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (Bio-Rad Laboratories, Tóquio, Japão). As manchas foram bloqueadas com 1% de caseína em solução salina tamponada com Tris (TBS) contendo 0,1% de Tween-20 (TBS-T) durante 1 h à temperatura ambiente e, em seguida, incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C. Abs primários contra LMAN2 (descrito anteriormente) e β-actina (Sigma-Aldrich) foram usadas. As membranas foram lavadas em TBS-T e incubadas com Ab peroxidase de rábano secundário marcado durante 1 h à temperatura ambiente. Ab complexos ligados foram detectados por quimioluminescência aumentada (Bio-RadLaboratories).
Isolamento de células CD8 + a partir de baços de ratos com GVHD
mediada por CD8 + células de ratos com GVHD foram utilizados em ensaios de migração Transwell e Stamper- Woodruff ensaios de ligação. Os linfócitos foram provocava a partir do baço, exibindo esplenomegalia, de ratos com GVHD e suspensas em meio RPMI-1640 a 4 ° C. As células foram dispersos pela rápida pipetagem, in-out, e os aglomerados de células foram removidos por passagem através de uma malha de nylon (Filtros celular; BD Biosciences). A suspensão de célula única resultante foi lavado três vezes no mesmo meio e ressuspensas a uma concentração de 3 x 10 7mononuclear células /ml. CD8 + células a partir da suspensão foram isolados por purificação de esférulas magnéticas utilizando microesferas de Miltenyi CD8a de acordo com o protocolo do fabricante (Miltenyi Biotec, Tóquio, Japão).
Transwell ensaio de migração de células efectoras
migração de células CD8 + células da DECH-baço foram avaliadas num sistema de TRANSWELL® de inserção em que os poços superior e inferior foram separadas pela membrana de policarbonato (tamanho de poro de 3 um; Corning, NY, EUA). CD8 +, células pré-incubados ou não com Ab anti-MBP (50 ng /ml), foram semeadas a uma densidade de 5 x 10 4 células /poço em 3 mícrons inserções Transwell. A câmara inferior foi preenchida com apenas ou meio contendo Homem (2 mM) a 500 ul de meio RPMI, uma mistura de homem e ACV (50 ug /mL), ou galactose (Gal, 2 mM; EY Laboratories). As células foram incubadas durante 4 h a 37 ° C (5% de CO 2) e, em seguida, coradas com Diff-Quik (Sysmex Corporation, Hyogo, Japão). actividade de migração foi avaliada como a percentagem de migração de células a partir da câmara superior do Transwell inserir para a câmara inferior em três campos de alta potência (100X) por poço. O experimento foi realizado em triplicado.
Ensaio de ligação Stamper-Woodruff (SWBA)
-Woodruff tipo Stamper ensaios de seção congelados foram realizados como descrito anteriormente [3]. Resumidamente, as alíquotas contendo 2,5 × 10 5 isolados CD8 + células em 200 ul de meio RPMI-1640 foram adicionados (8 um) cortes congelados da língua de ratos nos grupos de controle e GVHD recém-cortada. As secções foram agitados num agitador rotativo (60 rpm) durante 60 min à temperatura ambiente. Em seguida, a suspensão de células foi cuidadosamente decantado e as células aderentes às secções foram fixadas com glutaraldeído a 2,5% em PBS durante 5 min. As lâminas foram então lavadas em PBS e coradas com 0,5% de azul de toluidina. O número de aderentes CD8 + células foi determinada por exame de microscopia de luz de campos em 200 × ampliação (Cada campo de alta potência representaram aproximadamente 400 mm do epitélio oral). O número de células T CD8 + células ligadas directamente sobre KCs (mas não na camada córnea) foi contado. Várias experiências de bloqueio foram realizadas como segue: (a) secções congeladas de língua de ratos com GVHD foram incubadas com 25 ug /ml de ACV, PNA ou UEA-I durante 30 min à temperatura ambiente após uma breve lavagem com PBS, e depois adicionou- linfócitos; (B) CD8 + células foram pré-incubadas com 50 ug /ml de MBP Ab durante 30 minutos à temperatura ambiente, antes de toda a mistura de reacção foi transferida para as secções congeladas de GVHD-línguas; (C) as duas abordagens foram utilizadas simultaneamente, isto é, CD8 + células foram tratadas com MBP AB e as secções de tecido foram tratadas com MBP. Os resultados são calculados como a percentagem de linfócitos em relação ao controlo e secções de tecido expostas a tampão de ligação por si só.
Análise estatística A análise estatística foi realizada através da análise de uma via da variância (ANOVA) e testes de comparação múltipla de Scheffe para determinar estatística diferenças entre as amostras. Os dados são apresentados como a média ± desvio padrão (SD) e P
valores de & lt; 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.
Resultados
GVHD mucosa oral é caracterizado por ICAM-1 e de células T CD8 + se infiltra
Primeiro nós examinamos se a características de imuno-histoquímica pode ser detectada na mucosa oral durante o desenvolvimento da GVHD . Em linguetas de controlo não tratadas, não há alterações histológicas foram vistos com H & amp; E a coloração (Figura 1a). ICAM-1 foi restrita a células endoteliais e perivasculares dos vasos sanguíneos (Figura 1C). Apenas foram observados alguns células CD8 + na lâmina própria e epitélio oral (Figura 1e). Os resultados foram os mesmos em secções de tecidos retirados de ratos experimentais 8 dias após a injecção. No entanto, 10 dias após a indução de GVHD em LBNF 1 ratos, tanto alterações histológicas e imuno-histoquímicos foram observadas nas linguetas. H & amp; E coloração revelou lesões típicas de GVHD aguda mucocutânea, indicando degeneração eosinofílica citoplasmática e necrose epitelial de KCs (o chamado satelitose) resultante da infiltração de linfócitos intra-epiteliais (Figura 1b). ICAM-1 foi observada expressão no basal a camada espinhosa do epitélio (Figura 1D) e o número de células T CD8 + células aumento na lâmina da lingueta (Figura 1F). Além disso, estas células foram infiltrados no epitélio superficial, onde KCs epiteliais foram coradas com anticorpo anti-ICAM-1 Ab. A Figura 1 Expressão imuno-histoquímica da molécula intercelular-1 de adesão (ICAM-1) e CD8 + no enxerto-versus-hospedeiro (GVHD) -relacionados mucosa oral. a e b: Não ocorreram alterações óbvias são observados em hematoxilina e eosina (H & amp; E) -stained língua secções de controlo (a). Em secções de tecido de ratos com GVHD língua, destruição epitelial é observada (b). c e d: Em língua espécimes de ratos de controlo, a ICAM-1 é expressa apenas nas fendas vasculares (setas) (C). Epitelial expressão de ICAM-1 é observada no basal para camadas espinhosos da mucosa oral de ratos com GVHD (d). E e F: As células Apenas alguns CD8 + são encontrados no controlo (e). Nos ratos com GVHD, aumento do número de células CD8 + são observadas tanto na lâmina e da superfície do epitélio (f). A linha pontilhada mostra a junção entre o epitélio superficial e lâmina da lingueta. Bar = 100 mm.
Alterações na ligação LCA na mucosa bucal GVHD
Para elucidar se a expressão histoquímica do Homem na superfície celular em epitelial KCs é afectado pelo desenvolvimento de GVHD, examinamos coloração LCA nas línguas de controle e ratos GVHD. ligação ACV estava restrita à superfície celular do basal para KCs parabasais no epitélio superficial das linguetas a partir de ratos de controlo (Figura 2a). O mesmo padrão de coloração foi mostrado em secções de tecidos retirados de ratos experimentais oito dias após a injecção. Em contraste, o nível de coloração ACV estendido para as camadas de epitélio espinhoso superfície 10 dias após a injecção, o que indica que oligossacáridos sobre KCs pode ser modificada durante o desenvolvimento de DECH (Figura 2b). Além disso, o padrão de extensão de coloração ACV foi idêntico ao de ICAM-1. Figura 2 lectina Lens culinaris (LCA) de ligação na doença enxerto-versus-hospedeiro (GVHD) mucosa oral. ACV ligação ocorre na superfície da célula de células basal para parabasais em línguas de controlo (a). Coloração se estende para as camadas de epitélio espinhoso superfície em ratos com GVHD (b). A linha pontilhada branco circunscreve a camada epitelial da superfície da língua. Bar = 100 mm.
Expressão aumentada do complexo manosil em GVHD mucosa bucal
Nós próxima analisou a expressão imuno-histoquímica do complexo manosil, usando ALG11 Ab, em línguas de ambos os ratos controle e GVHD, para elucidar se o manosil poderia ser responsável pela adição de Man nos oligossacáridos em KCs durante o desenvolvimento da GVHD. Em língua normais, ALG11 ligado fracamente e /ou fracamente ao basais e parabasais KCs do epitélio de superfície (Figura 3a). locais reactivos com ALG11 estendido para o citoplasma de KCs nas camadas espinhosas do epitélio superficial nas linguetas de ratos com GVHD (Figura 3b). A gama reactivo com ALG11 parecia ser idêntica à do LCA de ligação, o que sugere que a expressão aumentada de manosil-transferase nas camadas epiteliais pode estar relacionada com extensa ligação do LCA. Figura 3 Detecção imunohistoquímica do complexo manosil na doença do enxerto contra hospedeiro (GVHD) mucosa oral -affected. ALG11, anticorpo (Ab) de complexo de manosil-transferase, é fracamente reactiva e fracamente em células epiteliais basais e parabasais de línguas de controlo (a). Em contraste, a coloração com ALG11 estende para queratinócitos (KCS) nas camadas espinhosas de linguetas a partir de ratos com GVHD (b). Bar = 100 mm.
MBP /Homem de ligação via induz CD8 + migração celular in vitro
Para elucidar se a migração de células T CD8 + células é mediada pela via MBP /Homem de ligação, examinamos a expressão MBP em as línguas dos ratos GVHD e o ensaio de migração transpoço para CD8 + células. Em primeiro lugar, examinamos a detecção imuno-histoquímica de secções de tecido MBP no da língua dos GVHD-ratos. MBP + células infiltrantes foram observados em ambas as lâmina e da superfície do epitélio superior das linguetas (Figura 4A). Também examinamos a expressão da proteína de MBP nas línguas e baço de ratos controle e GVHD por análise de Western blot. Como se mostra na Figura 4b, a quantidade de acumulação de MBP foi significativamente aumentada em ambos o língua e no baço de ratos com GVHD. Em contraste, a expressão de proteína MBP era fraco ou negativo tanto na língua e no baço de ratos de controlo (Figura 4b). Estes resultados sugerem que a MBP pode ser induzida em células efectoras relacionadas com a GVHD e MBP em células efectoras podem reagir contra o Homem da superfície celular de KCs nas linguetas de ratos com GVHD. Para testar esta hipótese, nós próxima realizados transpo� ensaios de migração para células efetoras. Como mostrado na Figura 5, a migração de células CD8 por cento + células ao homem aumentou drasticamente (77,9 ± 4,6) em comparação com o controlo (1,7 ± 0,6). A percentagem de migração de células CD8 + células tornou-se menor na câmara inferior contendo Homem e ACV (8,3 ± 0,7) e Gal (1,5 ± 0,7). Além disso, a migração de células CD8 + célula para homem diminuiu drasticamente (5,6 ± 0,4) quando as células foram pré-incubadas com o anti-MBP Ab. Estes resultados indicam que a migração de células CD8 + células ao homem é mediado pela via da PAM /homem de ligação. Figura 4 proteína de ligação a manose (MBP) na expressão da língua e do baço espécimes de enxerto-versus-hospedeiro (GVHD) ratos. células infiltrantes são expressos de forma imunohistoquímica por anticorpo de anti-MBP (Ab) (a). A análise Western blot dos níveis de MBP da língua e do baço de ratos GVHD (b) o controle e. Tanto a língua e do baço dos ratos com GVHD mediada por mostrar reacção notável com MBP. β-actina (ACTB) foi igualmente analisada como um controlo de carga. Barra = 100 um.
Figura 5 Indução de manose (Man) para migração de células CD8 +. migração de células T CD8 + foi analisada pelo ensaio de migração Transwell. Man, Homem com Lens culinaris
lectina (LCA) ou galactose foi colocada na câmara baixa também. Os poços da câmara superior receber CD8 + isoladas células, pré-tratados ou não com a proteína anti-manose de ligação do anticorpo (MBP) (Ab). RPMI foi utilizado como um controlo negativo. A figura representa resultados de três experimentos diferentes expressa ± como desvio padrão. Mesmos símbolos não mostram diferenças estatisticamente significativas. Outros, significativamente diferentes em P Art & lt; 0,05.
Ab anti-MBP e ACV inibir a adesão das células CD8 + para KCs em espécimes língua de ratos com GVHD
No modelo de rato GVHD, as células efectoras podem ligar-se a lesional KCs pela ICAM-1 /LFA-1 via de [3]. Foi realizada SWBA usando CD8 + células e /ou células epiteliais bucais retiradas de ratos com GVHD, para fornecer evidência de um papel directo da via MBP /Homem de ligação na ligação de CD8 + células epiteliais KCs . O pré-tratamento das secções de tecido preparadas a partir da mucosa oral com PNA e UEA-I não teve nenhum efeito, ao passo que diminuiu a adesão de linfócitos ACV por 42,3% do valor de controlo (Figura 6). Quando os linfócitos de ratos com GVHD foram incubadas com anti-MBP Ab, a adesão de linfócitos a células epiteliais KCs foi de 42,7% do valor de controlo (Figura 6). Quando as duas abordagens foram aplicados simultaneamente, isto é, quando os linfócitos foram tratados com anti-MBP AB e as secções de tecido foram tratadas com ACV, a adesão de linfócitos foi reduzida para & lt; 40% do valor de controlo (Figura 6). Estes resultados indicam que a adesão de células T CD8 + células epiteliais KCs é mediada, em parte, pela via de PAM /homem de ligação. Figura 6 Efeito de lectinas e anti-proteína de ligação a manose-(MBP) de anticorpo (Ab) sobre a adesão de células T CD8 + para o epitélio oral na GVHD. A adesão das células CD8 + para os queratinócitos orais (KCS) foram investigados por Stamper-Woodruff ensaio (SWBA) de ligação. A ligação de células CD8 + foi significativamente reduzida quando as células foram pré-tratados com o anti-MBP Ab, bem como os epitélios quando foram pré-tratados com Lens culinaris
lectina (ACV). A figura representa os resultados de três experimentos diferentes e expressos em média ± desvio padrão. Mesmos símbolos não mostram diferenças estatisticamente significativas. Outros, significativamente diferentes em P Art & lt; 0,05.
Discussão Neste estudo utilizamos o haploidentical alogênico F 1 modelo de rato híbrido para elucidar o papel da expressão de superfície celular de resíduos homem pelo KCs em GVHD. Embora este modelo não representa diretamente transplante de células hematopoiéticas clínico em humanos, ele fornece um sistema conveniente e geneticamente bem definida de que para obter insights sobre os mecanismos subjacentes danos teciduais mediadas pelo sistema imunológico do tecido epitelial de acolhimento através do estudo in vivo
interações entre KCs e linfócitos [17]. Apresenta-se três linhas de evidência para apoiar a conclusão de que a expressão da superfície celular de Man por KCs desempenha um papel na migração e /ou a adesão de células T CD8 + células do epitélio ao longo do desenvolvimento da GVHD. Em primeiro lugar, uma abordagem lectina histoquímica confirmou que a expressão da superfície celular de Man por KCs foi sobre-regulada no desenvolvimento de GVHD. Em segundo lugar, a expressão da proteína e os resultados de migração transpo� indicou que a migração CD8 + celular para homem estava relacionada a uma interação entre MBP e do Homem. Em terceiro lugar, CD8 + adesão celular do epitélio superficial da mucosa foi mediada pela via MBP /homem de ligação como revelado utilizando SWBA.
Um aumento da regulação da ligação ACV na superfície da célula de KCs indica que o cell- expressão na superfície do Homem é modificado durante o desenvolvimento da GVHD mucosa oral. Em GVHD mucocutânea, alterações moleculares específicos ocorrem em KCs para permitir a migração de linfócitos para a camada epitelial da superfície [7, 8, 18]. Um estudo anterior tenha relatado que a indução de ICAM-1 em KCs conduz à migração de células CD8 + células no epitélio e que este processo é mediado em parte pela ICAM-1 /LFA-1 via [3] . Os resultados aqui apresentados fornecer suporte adicional para alterações moleculares em KCs durante o desenvolvimento da GVHD mucsal oral. O estudo imuno-histoquímico de anti-ALG11 Ab relatado aqui mostra que os locais reactivos Ab também expandir-se para camadas espinhosa no epitélio de superfície na língua GVHD. ALG11 é conhecido como alfa-1,2-manosil-transferase na glicoproteína ligada a N e está localizada ao lado citosólica do retículo endoplasmático em células basais de epitélio escamoso normal [19]. Estes resultados sugerem que a expressão de grande complexo manosil-transferase pode ser indirectamente responsável pela regulação positiva da expressão do homem sobre a superfície celular de KCs na língua GVHD. o trabalho futuro vai resolver porque a expressão do complexo de manosil-transferase e homem se expandir durante o desenvolvimento da GVHD.
mancha imuno-histoquímica e Western análises apresentados aqui revelam que as células efectoras de GVHD mostram a expressão de MBP utilizando LMAN2 Ab, além de CD8. MBP, também chamada proteína de ligação a manana ou lectina de ligação a manana, é um Ca2 + - dependente (tipo C) animais lectina [20-22]. Um estudo recente revelou que esta proteína pode exibir um efeito específico sobre a activação da célula T [23]. MBP se liga preferencialmente aos hidratos de carbono terminados com Man, N-acetil-glucosamina, ou fucose [24]. Portanto, os linfócitos MBP expressando parecem interagir com KCS-expressando Homem na GVHD mucosa oral. Os resultados do ensaio de migração Transwell indicam que a migração da CD8-MBP expressando + células é acelerado por meio contendo Homem. CD8 migração + celular foi inibida por uma mistura de homem e LCA e pré-tratamento de células com LMAN2 Ab, indicando que MBP em CD8 + células reconhecido Man especificamente. Estes resultados sugerem que a migração de células efetoras, CD8 + linfócitos, para Man-expressando KCs podem ser mediados por uma interação entre MBP e Man.
CD8 + célula-adesão ao epitélio coradas com Man- ACV específica foi demonstrada utilizando SWBA. Assim, a ligação de CD8 + células no epitélio de superfície durante o desenvolvimento da GVHD aumentos, juntamente com a expressão do homem e se correlaciona com a progressão da doença. Estes resultados são consistentes com as observações in vivo
de CCS expressando específica ACV-Man a aderir a CD8 + células durante a progressão de GVHD. Em um processo de adesão, MBP sobre CD8 + células desempenha um papel importante como um fator adesivo do Homem-expressando KCs durante o desenvolvimento da GVHD. Além disso, os resultados da LCA e experiências Ab-bloqueio apoiou a ideia de que interações MBP /MAN representam a ligação de CD8 + células. Assim, LMAN2 Ab, LCA, ou LMAN2 Ab juntamente com LCA, bloqueou todas CD8 + células-ligação em comparação com lecitns reconhecendo resíduos Homem não relacionados. O nosso estudo anterior revelou que a indução de ICAM-1 em KCs conduzido para a adesão de células T CD8 + células para o epitélio da superfície e que este foi mediada em parte pela ICAM-1 /LFA-1 via de [3]. As interacções /MAN MBP aqui apresentados pertencem a uma outra via de adesivo para a migração e adesão de células efectoras no epitélio de superfície durante o desenvolvimento de GVHD da mucosa oral.
Em resumo, estes resultados definir o papel da expressão no homem durante o KCs desenvolvimento de GVHD como induzir a migração de células que expressam CD8 MBP + para dentro do epitélio bucal, onde eles aderem a KCs. A regulação positiva da expressão do homem no KCs é, sem dúvida, um passo fundamental na patogênese da GVHD mucosa oral.
Conclusão
Um aumento da expressão do homem no KCs leva à migração e /ou adesão de CD8 + células em o epitélio superficial e este é mediada em parte pela via MBP /Man durante o desenvolvimento da GVHD mucosa bucal
abreviações
ACTB:.
β-actina
Ab:
Antibody
GVHD:
doença do enxerto-versus-hospedeiro
H & amp; e:
