Abstract
Fundo
grupo mutans (Streptococcus mutans
e S. sobrinus
) são considerados principais agentes etiológicos da cárie dentária. Usando um método de reação em cadeia da polimerase, detectamos essas bactérias de 145 pacientes ambulatoriais (6-30 anos) com deficiência intelectual (ID) e sua presença foi comparada com a incidência de cárie dentária.
Métodos
amostras de placa foram recolhidos de todo irrompeu locais de dentes em indivíduos com uma escova de dentes estéril. Um exame dentário foi realizado para determinar o número de dentes cariados e obturados (pontuação DFT) na dentição permanente usando a OMS cárie critérios diagnósticos. A U-teste de Mann-Whitney foi utilizado para comparar os escores de cárie entre combinações de bactérias, e com um teste de classificações de Wilcoxon utilizado para comparar as pontuações de cárie entre a linha de base e após 1 ano.
Resultados
Entre todos os assuntos, S. mutans e S. sobrinus
estavam possuídos por 78,7 e 83,5%, respectivamente, enquanto 13,1% foram positivas para S. mutans
sozinho, 17,9% para S. sobrinus
sozinho, e 65,6 % para os dois organismos, com 3,4% foram negativas para ambas. A pontuação média DFT de indivíduos positivos para ambos S. mutans e S. sobrinus
Restaurant at depois de 1 ano foi significativamente maior do que daqueles positivos para S. mutans
sozinho (P Art & lt; 0,01 ). O aumento do incremento de cárie também foi significativamente maior nos indivíduos com ambas as bactérias detectadas (P Art & lt; 0,001).
Conclusão
Nossos resultados indicam que os pacientes com ID abrigar ambas S. mutans e S.
sobrinus
têm uma incidência significativamente maior de cárie dentária do que aqueles com S. mutans
sozinho.
Fundo
grupo mutans (Streptococcus mutans
e S. sobrinus
) são considerados principais agentes etiológicos da cárie dentária em humanos [1-3]. Estas bactérias são os patógenos putativos mais comuns isoladas de placa dentária humana e sua prevalência tem sido relatada em estudos epidemiológicos [4-7]. Vários métodos têm sido utilizados para a detecção de agentes patogénicos putativos, incluindo microscopia directa, cultivo, ensaios enzimáticos, ensaios de imunoabsorção ligados a enzima e espécies de sondas de ADN específicas. Vários investigadores também foram desenvolvidos métodos de reacção em cadeia da polimerase (PCR) e relataram que eles sejam mais sensíveis para a detecção, em comparação com técnicas de cultura convencionais [8, 9], em que foram mostrados para ser capaz de detectar números baixos (5-100) das células bacterianas [9, 10], enquanto eles são também relativamente rápido e simples de realizar. Além disso, ensaios de PCR foram encontrados adequado para a detecção específica e identificação de bactérias cariogênicas humanos, incluindo S. mutans e S. sobrinus
[10, 11].
Em estudos transversais e longitudinais anteriores, informamos que as crianças pré-escolares com dentição decídua abrigar tanto S. mutans
e S. sobrinus
tiveram uma incidência significativamente maior de cárie dentária do que aqueles com S. mutans
sozinho [6, 12]. Recentemente, nós também observou que os alunos abrigar ambas S. mutans
e S. sobrinus
tinha uma significativamente maior experiência de cárie dentária em ambos os dentes decíduos e permanentes, em comparação com aqueles com S. mutans
sozinho [13] . Assim, a identificação e determinação da prevalência dos patógenos são de fundamental importância para a compreensão do início e desenvolvimento da cárie dentária, e para determinar melhores formas de tratamento e prevenção. No entanto, poucos estudos longitudinais da relação entre estas duas espécies e atividades de cárie em crianças [12, 14] ou indivíduos com deficiência intelectual (ID) [15] e síndrome de Down [16] foram realizados.
Indivíduos com ID que são cuidadas em casa por membros da família também podem sofrer de má higiene oral, como contagens bacterianas superiores foram encontrados em indivíduos com ID, em comparação com aqueles sem deficiência [17]. Os métodos disponíveis para tratar e prevenir a cárie dentária, e melhorar os indivíduos de higiene bucal com deficiências graves são limitados. No entanto, é importante que os médicos a escolher de entre as várias técnicas disponíveis para a prevenção da cárie dentária em seus pacientes com ID de acordo com o risco. No presente estudo, detectamos S. mutans
e S. sobrinus
em pacientes japoneses com ID usando um método de PCR, em seguida, em comparação a sua presença com a incidência de cárie dentária ao longo de um período de 1 ano.
Métodos
cento e quarenta e cinco pacientes ambulatoriais com ID (um quociente de inteligência (QI) ≤ 70) com idade entre 6 a 30 anos e cada um com dentição mista ou permanente, que visitou o Hospital da Universidade de Hiroshima, Hiroshima City foram inscritos. Os dados demográficos dos pacientes ambulatoriais e dados participantes sobre o seu estatuto de deficiência, IQ, doenças sistêmicas e história de medicamentos regulares (se houver) foram coletados a partir dos prontuários. Os indivíduos foram composta de 135 com ID e 10 com síndrome de Down, e um total de 106 (73,1%) do sexo masculino e 39 (26,9%) do sexo feminino foram examinados (Tabela 1). Consentimento para participação foi obtido a partir de pelo menos um de seus pais antes do estudo de acordo com as diretrizes éticas da Declaração de Helsinki (1975) ea depuração ética foi obtida a partir do Comitê de Ética da Universidade de Hiroshima (Epidemiologia-No. 34). Cada sujeito foi submetido a um exame odontológico realizado na Clínica Dental Special Care por um único dentista bem treinado (MO), enquanto sentado em uma cadeira odontológica em decúbito dorsal, utilizando a OMS cárie critérios de diagnóstico para determinar os dentes cariados e obturados (DFT) índice [18]. Aqueles que tinham recebido antibióticos nos últimos 3 meses ou com doenças sistêmicas foram excluded.Table população 1 Estudo por idade e sexo
Age
Male
Female
Total
(years)
No.
%
No.
%
6–10
12
92.3
1
7.7
13
11–15
19
86.4
3
13.6
22
16–20
21
77.8
6
22.2
27
21–25
32
69.6
14
30.4
46
26–30
24
64.9
13
35.1
37
placa dental foi coletado de todos os dentes erupcionados por escovar com uma escova de dentes estéril para 1 min usando um método descrito anteriormente [19]. Durante a escovação, a placa aderindo à escova de dentes foi removido por lavagem várias vezes em um tubo de água destilada estéril. As amostras de placa no tubo foram imediatamente transportadas para o nosso laboratório de pesquisa e armazenado a -20 ° C, antes da extracção do ADN genómico.
Streptococcus mutans
JCM5175 e S. sobrinus
ATCC27607 foram usadas como espécies de controle . detecção por PCR das espécies alvo foi realizada utilizando os iniciadores descritos por Igarashi et al. [8, 10]. primers de oligonucleotídeos foram desenhados para o dex
sequência de DNA de S. mutans
(GenBank não. D49430) e
S. sobrinus (GenBank não. M96978). Para S. mutans
, o iniciador de sentido directo, 5 'TAT GCT GCT TCA GGA GGT TC 3', é complementar à sequência de 973-992, e o iniciador inverso, 5 'AAG GTT GAG AAC TTG AAT CG 3', é complementar para a sequência 2225-2244. Para S. sobrinus
, o iniciador de sentido directo, 5 'TGC TAT CTT CTA GCA TCC TG 3', é complementar à sequência de 134-153, e o iniciador inverso, 5 'GGT CGG ATT TTT GAC TGC 3', é complementar da sequência 1726-1743.
os iniciadores para a sequência de ARN 16S ribossomal Eubacteria (GenBank número de acesso M75035) foram utilizados para confirmar a presença de bactérias em amostras de placa como controlo positivo [20]. O iniciador directo, 5 'CAG GAT CCC TAG ATA TGG TAG ACG TCC C 3', é complementar à sequência de 783-810, e o iniciador inverso, 5 'GAC GGG CGG TGT GTA CAA GGC CCG ACG GGA 3', é complementar para a sequência 1378-1407. O tamanho do produto esperado de PCR foi de 625 pb.
Amostras de chapa foram submetidas em primeiro lugar a centrifugação a 1600 × g durante 20 min
. Em seguida, o sobrenadante foi rejeitado, e os sedimentos celulares individuais foram armazenados a -20 ° C até o isolamento de ADN, para as quais os sedimentos foram ressuspensos em 180 ul de tampão de lise enzimática (Tris-HCl a 20, pH 8,0; 2 mM de EDTA; 1,2% Triton X-100, 20 mg /ml de lisozima). A preparação de ADN genómico a partir de cada amostra da placa foi obtido utilizando um kit de DNeasy® sangue e do tecido (Qiagen, Austin, TX, EUA) para a extracção do ADN de bactérias Gram-positivas, ao qual adicionado um tratamento com RNase [21]. concentrações de ADN nas amostras de placa dental foram determinadas medindo A
260, enquanto a qualidade foi estimada usando o A
260 /A
280 ratio [22].
polimerase amplificação por reacção em cadeia foi realizada numa mistura reaccional (25 ul) consiste em grânulos de PCR (GE Healthcare UK Limited, Little Chalfont, Buckinghamshire, Reino Unido) que continha uma enzima (duas unidades de Taq DNA polimerase
) e o necessário reagentes, bem como 25 pmol de cada iniciador, e 20 a 50 ng de ADN molde a solução num termociclador (PTC-ADN do motor 220 díade TM, MJ Research, Hatoboro, PA, EUA). Cada conjunto de análises PCR incluiu um controlo negativo (branco água), para além do controlo positivo. A mistura reaccional foi desnaturada a 95 ° C durante 3 min, seguido por 26 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 1 min, emparelhamento a 55 ° C durante 1 min, e extensão a 72 ° C durante 1 min, com um ciclo final de 94 ° C durante 1 min, 55 ° C durante 1 min, e 72 ° C durante 5 min [8]. A seguir à amplificação, 15 ul de produtos de PCR foram analisados por electroforese num gel de agarose 1,0% e, após coloração com brometo de etídio, os fragmentos de DNA sintetizados de novo foram visualizadas sob luz ultravioleta a 302 nm. Os tamanhos dos produtos de PCR foram estimados a partir da migração electroforética de produtos em relação a um marcador de escada de base 100 (Amersham Pharmacia Biotech, AB, Uppsala, Suécia). A sensibilidade do método de PCR foi testado usando quantidades conhecidas de S. mutans purificados
JCM5175 e S. sobrinus
ATCC27607 como molde. Diluídas em série de ADN também foi utilizado como um molde, e o limite de detecção era de 1 pg de ADN de S. mutans
(12 células) e 100 fg de ADN molde para S. sobrinus
(9 células) (dados não mostrado). e estatísticas descritivas e as análises estatísticas foram realizadas utilizando um pacote estatístico (SPSS 14.0, Inc., Chicago, IL, EUA). A Mann-Whitney U-test foi utilizado para comparar os escores de cárie entre os sujeitos que possuem as várias combinações de bactérias, e um teste de Wilcoxon Rank para comparar cárie pontuação entre a linha de base e um ano mais tarde.
Resultados da Tabela 2 mostra prevalência de cárie em indivíduos com ID possuindo S. mutans
sozinho ou em combinação com S. sobrinus
no início do estudo e após 1 ano. S. mutans e S. sobrinus
foram encontrados em 78,7 e 83,5%, respectivamente, dos nossos indivíduos com ID. Além disso, 13,1% foram positivas para S. mutans
sozinho, 17,9% para S. sobrinus
sozinho, e 65,6% para ambos, enquanto 3,4% foram negativos para ambos os S. mutans e S. sobrinus
. A pontuação no DFT daqueles positivos para ambos os organismos depois de 1 ano foi significativamente maior do que daqueles positivos para S. mutans
sozinho (P
& lt; 0,01). Além disso, essa pontuação em indivíduos positivos para ambos depois de 1 ano foi significativamente mais elevada do que na linha de base (P
& lt; 0,001) e o aumento da pontuação no DFT daqueles positivos para ambos foram significativamente maiores do que em indivíduos positivos para S. mutans
sozinho (P Art & lt; 0,01)
Tabela 3 mostra indivíduos com experiência de cárie anteriores no início e cárie aumentos incrementais após 1 ano, juntamente com a combinação de estreptococos mutans detectado.. Dezessete (89,5%) com S. mutans
sozinho, e 86 (90,5%), com ambos os S. mutans
e S. sobrinus
tiveram experiências de cárie passadas. Quatro (21,1%) dos indivíduos com S. mutans
sozinho, 9 (34,6%) apenas com S. sobrinus
, e 54 (55,7%), com ambos tiveram aumentos de incremento de cárie, enquanto que nenhum dos indivíduos possuindo nenhum organismo mostraram um aumento no incremento. Além disso, aproximadamente 60% dos indivíduos com ambos tiveram um aumento na cárie incremento sobre o período de estudo de 1 ano, enquanto que aproximadamente 20% das pessoas com S. mutans
sozinho demonstrou uma prevalência cárie tais increase.Table 2 em pacientes com S. mutans
sozinho ou em combinação com S. sobrinus
no início do estudo e após 1 ano
Oraganism presente
Média (DP) DFT
Aumento da DFT
Faixa
S. mutans
S. sobrinus
No. dos sujeitos (%)
Base
Após 1 ano
Média (DP)
+
-
19 (13,1)
6,47 (4,64)
6,95 (4,61) *
0,47 (1,22) *
0 -5 Portal Imobiliário -
+
26 (17,9)
5,96 (5,03)
6,42 (5,33)
0,46 (0,71)
0-2
+
+
95 (65,6)
8,65 (7,60) †
10,31 (8,13) * †
1,65 (2,04) *
0-9 Portal Imobiliário -
viajantes -
5 (3.4)
0,60 (1,34)
0,60 (1,34)
0.00 (0.00)
0
significância estatística entre os grupos: * P Art & lt; 0,01, Mann-Whitney U-teste; † P
. & Lt; 0,001, teste de classificações de Wilcoxon
dados para pontuação DFT são apresentados como média (SD)
Tabela 3 Pacientes com experiência anterior de cárie no início e aumentos incrementais após 1 ano, e a combinação de estreptococos mutans detectado
Organismo presente
cárie experiência anterior
cárie aumento gradual
S. mutans
S. sobrinus
No.
%
No.
%
+
-
17
89.5
4
21.1
-
+
22
84.6
9
34.6
+
+
86
90.5
54
55.7
-
-
1
20.0
0
0.0
análise de PCR com 16S rRNA primers confirmou a presença de DNA de bactérias em todas as amostras de placa (dados não mostrados).
Discussão
Indivíduos que são intelectualmente deficientes e cuidadas em casa por membros da família muitas vezes sofrem de má higiene oral, como eles têm sido relatados para ter mais elevadas contagens bacterianas, em comparação com indivíduos sem nenhuma deficiência [17]. Os métodos disponíveis para o tratamento e prevenção de cáries dentárias, e também melhorar a higiene oral para pacientes com deficiências graves são limitados, no entanto, é importante para os clínicos para escolher uma técnica apropriada para a prevenção da cárie dentária baseado no risco de o seu desenvolvimento nas suas pacientes com ID.
Realizamos o presente estudo longitudinal para comparar a presença de estreptococos mutans com a incidência de cárie dentária em pacientes japoneses com ID ao longo de um período de 1 ano usando um método de PCR. A concentração média de DNA recuperado de escovar amostras de placa era de aproximadamente 700 ug /ml, que foi considerada suficiente para a realização desta pesquisa baseada em PCR. Para garantir a presença de uma amostra representativa de bactérias em todos os casos e ausência de substâncias inibidoras de PCR, foi realizado um amplo alcance ensaios de PCR utilizando primers baseados no rRNA 16S eubacterianas e submetendo todas as amostras obtidas pelo método de escovação. Isto confirmou a presença de bactérias e ADN bacteriano em todas as amostras de placa (dados não mostrados). Este método tem demonstrado ser um meio mais sensíveis de detecção de microorganismos causadores da cárie, em comparação com técnicas de cultura convencionais [8-11].
Os resultados do presente estudo indicam que a prevalência de estreptococos mutans em pacientes com idade ID 6-30 anos de idade é de 96,6%, o que está de acordo com pesquisas semelhantes realizadas com crianças em idade escolar em outras partes do mundo [23-26], enquanto a prevalência de estreptococos mutans em adultos tem sido relatada a ser superior a 60% [27] e 82,7% em indivíduos com síndrome de Down com idade entre 1-48 anos de idade [16]. A prevalência de sozinho S. sobrinus
no presente estudo foi maior do que nos estudos. No entanto, esses estudos métodos culturais e descobertas anteriores empregues têm mostrado que ágar-bacitracina mitis salivarius inibe o crescimento de S. sobrinus
a um grau maior do que a de S. mutans
[28, 29]. Assim, os resultados contrastantes pode ter sido devido ao método de isolamento e detecção mais sensível utilizado para S. sobrinus
no nosso estudo, em comparação com as utilizadas no passado, bem como as diferenças no tipo e estágio da lesão de cárie no assuntos. No entanto, uma vez que a presente coorte foi limitado, estudos adicionais são necessários.
A pontuação DFT no daqueles positivos para ambos os organismos no fim de 1 ano foi significativamente maior do que a daqueles positivos para S. mutans
sozinho. Além disso, essa pontuação em indivíduos positivos para ambos depois de 1 ano foi significativamente maior do que no início do estudo e do aumento da pontuação DFT naqueles positiva para ambos foi significativamente maior do que em indivíduos positivos para S. mutans
sozinho. O aumento gradual da cárie para os indivíduos que possuem ambos os organismos foi de 3,5 vezes maior do que para aqueles com S. mutans
sozinho, indicando que os indivíduos com ID possuindo ambos têm maiores atividades de cárie que aqueles com apenas S. mutans
. Em nosso estudo anterior, o aumento na pontuação da DFT para dentes decíduos em crianças pré-escolares que possuem ambos foi quatro vezes maior do que para aqueles que possuem S. mutans
sozinho [12]. Os presentes resultados da PCR mostraram que indivíduos com ID que possuem ambos os S. mutans
e S. sobrinus
tinha uma significativamente maior incidência de cárie e aumento incremento em comparação com aqueles com apenas S. mutans Restaurant at após 1 ano, que também concorda com os resultados de estudos anteriores de escolares de 11-12 anos de idade [30, 31], bem como estudos de crianças pré-escolares com idades entre 3-5 anos [6, 12, 32]. Em contraste, não houve diferença significativa na pontuação da linha de base para DFT entre indivíduos positivos para ambos os
S. mutans e S. sobrinus
e aqueles com S. mutans
sozinho, embora o marcador DFT daqueles positivos para tanto S. mutans
e S. sobrinus
mostrou uma tendência a ser maior do que a daqueles com S. mutans
sozinho.
Os actuais temas estavam a ser tratados em ambulatório e foram encaminhados de odontologia local clínicas por causa de sua cooperação dental pobre e já tinha dentes cariados não tratados. Todos os dentes cariados foram imediatamente tratados na Clínica Dental cuidados especiais, assim, as cáries aumento gradual em indivíduos positivos com ambas S. mutans
e S. sobrinus
foi significativamente maior do que naqueles com S. mutans
sozinho . Em estudos anteriores, os indivíduos que possuíam as duas bactérias tiveram aumentos no incremento de cárie ao longo de um período de 1 ano [14, 33]. Os resultados desse estudo anterior sugeriu que a prevalência de S. sobrinus
mais associada com a atividade futuras cáries, especialmente com o aumento do incremento de cárie de superfície lisa, que a prevalência de S. mutans
. No entanto, a população de sujeitos no presente estudo foi limitado, portanto, são necessários mais estudos. Além disso, continua a ser desconhecido como a colonização mista aumenta a cariogenicidade de bactérias, enquanto são necessários estudos quantitativos usando um PCR em tempo real quantitativo para compreender os mecanismos de aumento do risco de cárie para estudos futuros.
Seventeen (89,5%) com S. mutans
sozinho, e 86 (90,5%), com ambos os S. mutans
e S. sobrinus
tiveram experiências de cárie passadas. Quatro (21,1%) dos indivíduos com S. mutans
sozinho, 9 (34,6%) apenas com S. sobrinus
, e 54 (55,7%), com ambos tiveram aumentos de incremento de cárie, enquanto que nenhum dos indivíduos possuindo nenhum organismo mostraram um aumento no incremento. Além disso, aproximadamente 60% dos indivíduos com ambos tinham um aumento gradual da cárie ao longo do período de estudo de 1 ano, enquanto que aproximadamente 20% das pessoas com S. mutans
sozinho demonstrou um tal aumento.
Conclusões Em
Concluindo, os resultados do presente estudo longitudinais indicam que indivíduos com ID abrigar ambas S. mutans
e S. sobrinus
têm uma incidência significativamente maior de cárie dentária do que os positivos para S. mutans
sozinho.
declarações
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concorrentes. interesses
os autores declaram que não têm interesses conflitantes. contribuições
dos autores
YO, FH e MO desighned o estudo. MO realizado o exame dentário. YO e MO coletadas amostras de placa. YO e FH realizado o ensaio de PCR convencional. YO e MO foram responsáveis pela análise dos dados. Todos os autores participaram do processamento de manuscritos e aprovaram a versão final.
