Abstract
Fundo
Devido ao aumento das taxas de câncer de orofaringe, infecção oral por HPV é uma preocupação significativa. Os métodos para detectar HPVs orais não é padronizado como existem diferentes técnicas disponíveis. Propomos que o uso de amostras de lavagem oral para detectar o HPV é uma técnica adequada dentro de uma clínica. Assim, o nosso principal objectivo é estudar a detecção de HPV em amostras de lavagem oral.
Métodos
Em nosso estudo, utilizamos a coleta de amostras lavagem oral juntamente com PCR em tempo real para detectar HPVs tipos 16 e 18, e preferencialmente amplificado FAP amostras de PCR para detectar uma ampla gama de HPVs, no carcinoma de células escamosas da orofaringe (OPSCC), não OPSCC, e pacientes saudáveis.
resultados
Trinta e três por cento dos 100 doentes com cancro foram positivas para qualquer tipo de HPV ; Destas 23 foram positivos para HPV16. Apenas 1 de 110 controles saudáveis foi positivo (este assunto foi positivo para HPV18).
Conclusão
Nossos resultados indicam que a detecção do HPV em amostras de lavagem oral pode ser útil como uma ferramenta de triagem para detectar cancros orais associadas ao HPV.
Fundo
tecidos infectados pelo papilomavírus humano (HPV) têm a capacidade de evoluir para um câncer associado ao HPV. Isto é provavelmente devido a um efeito de campo em que o HPV é possível modificar as funções celulares normais, resultando em malignidade. Embora sabemos como testar para cânceres relacionados com o HPV, não há atualmente nenhum padrão para detectar a infecção por HPV [1], e triagem para HPV poderia identificar os indivíduos em risco de cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas (CECP). Falando nisso, casos CECP associados com HPV têm sido um desafio para rastrear, carcinoma de células escamosas da orofaringe (OPSCC) casos de carcinoma de células escamosas da cavidade especialmente oral (CCEO) e, que são subconjuntos de CECP. A área orofaríngea inclui a base da língua, palato mole, amígdalas, e tonsila, com a cavidade oral que abrange o resto dos tecidos interiores da boca. Os métodos mais comuns para a detecção de HPV dentro da boca e orofaringe começar com conjunto de células com um cotonete de algodão, cytobrush, ou uma lavagem da boca [2], seguido do uso de ensaios ou ADN baseados em PCR hibridação in situ [3]. No entanto, existem desafios presentes em certas técnicas. Por exemplo, o uso de uma haste de escova /limita a quantidade de mucosa que é amostrado, e a obtenção de uma amostra a partir de uma lesão não-visíveis dentro da cripta tonsilar pode não ser viável [4]. A base da língua não é inteiramente acessível, quer como existe tanto mucosa plana e tecido tonsilar, aumentando assim o risco de falsos negativos [5]. Optamos por utilizar uma técnica de lavagem de boca para coleta de amostras, uma vez que é não-invasivo, rápido e simples para o paciente. Expressão
Analisando p16 tem sido usado como um biomarcador para associados ao HPV CEB /OPSCC, mas estudos relataram que a sobre-expressão de p16 não está sempre presente em casos que envolvem os HPVs oncogênicos [6-9]. Um estudo recente concluiu que o p16 não deve ser utilizado como um marcador substituto para a infecção por HPV em cancros orais devido à má concordância entre os dois [10]. Anterior a esta, Pannone et ai. também afirmou que imuno-histoquímica p16 (IHC) por si só não provar ser um método confiável para detecção do HPV para os casos de CCEO /OPSCC [11]. Dentro do nosso estudo, obtivemos informações para testes de p16 para ver se ou não os nossos dados HPV estava em concordância. Incidência
OPSCC nos países desenvolvidos aumentou significativamente e infecção pelo HPV é proposto para ser o principal fator [12]. fatores de risco para a infecção pelo HPV oral incluem certas práticas sexuais [13-16]; número de parceiros ao longo da vida e do número de parceiros sexuais recentes, idade avançada, ser do sexo masculino, e tabagismo atual [17, 18]. O tipo mais prevalente de HPV associado com a infecção por via oral é o tipo 16 [17, 19], que tem sido demonstrado ser oncogénica em HNSCCs [20]. Uma revisão sistemática mundial de biópsias CECP demonstrado HPV16 em 31% dos casos OPSCC; 16% dos casos de CCEO; e 17% dos casos de SCC laringe [21]. HPV tipo 18 também parece desempenhar um papel significativo na carcinogênese, especialmente na orofaringe [22, 23].
Com a ascensão do OPSCCs é imperativo ter uma técnica padrão-ouro no lugar para a detecção de HPV oral. A recolha de amostras a partir da cavidade oral, orofaringe e para a detecção de HPV orais deve ser rápido, não invasivo, de baixo custo, e suficiente na recolha de ADN de HPV. Em nosso estudo, nós investigamos amostras de lavagem oral juntamente com real-time PCR Taqman para detectar HPV tipos 16 e 18, que é sensível e específico. População do estudo para detectar uma ampla gama de HPVs, nós preferencialmente amplificado as amostras lavagem oral de casos de câncer, e fluorescentes usadas arbitrariamente preparado (FAP) PCR, um método geral de PCR utilizando iniciadores de HPV degenerados.
entre 2011 e 2013, recrutou 76 OPSCC e 24 pacientes não-OPSCC do Cancer Care Alliance Seattle (Seattle, WA), e 110 indivíduos saudáveis de University of Dental Clinic Washington (Seattle, WA). Os casos não OPSCC incluiu pacientes com cancros CCEO, laringe, sinusite, e supraglote. Nós selecionados os horários de cinco oncologistas, a fim de identificar pacientes com câncer elegíveis, e discutido o nosso estudo na sua nomeação. Um paciente diminuiu devido à feridas na boca e sensibilidade. 21/100 pacientes com câncer já tinha começado o tratamento e destes 21 pacientes: 18 pacientes tiveram o tratamento menos de 21 dias antes da amostragem, dois tinham mais de 30 dias de tratamento, e um paciente teve o tratamento por 7 meses. indivíduos saudáveis foram selecionados aleatoriamente dentro da clínica odontológica estudante, um paciente recusou-se a participar do estudo. requisitos de inclusão para a população saudável incluídos ser: livre do câncer, não está grávida, HIV-livre, e com idade superior a 16. Cada paciente assinou o termo de consentimento por escrito para participar do estudo (IRB # 7490 aprovado 09 de abril de 2014), e responderam a um questionário de saúde simples. Sexo, idade, raça, tabagismo, álcool e história de maconha foram registrados para todas as disciplinas. Gráficos para um subconjunto de nossos pacientes foram revistos para imuno-histoquímica p16 (IHC) e teste de HPV
Métodos
Coleção & amp.; métodos de purificação de ADN Compra de recolha de amostras, todos os pacientes lavadas e gargled por 30 s com Original Mint Scope® bochechos (Procter & amp; Gamble). Quatro indivíduos saudáveis normais solicitado para usar Crest® bochechos sem álcool devido a um histórico de alcoolismo. amostras de lavagem oral foram centrifugadas durante 15 min. a 4 ° C, para formar um pelete, o sobrenadante foi rejeitado e o sedimento foi colocado em -80 ° C até posterior processamento. O Kit de Purificação de DNA Puregene® foi usada para isolar o ADN genómico a partir do sedimento de células bucal dentro das amostras de lavagem bucal (Qiagen produto # 158467, o protocolo do fabricante foi seguido).
Todos os sujeitos humanos e protocolos regulamentos IRB foram seguidos no âmbito do Fred Hutchinson Câncer . diretrizes Centro de Pesquisa (IRB # 7490 aprovado 09 de abril de 2014)
HPV & amp; métodos analíticos
Taqman ensaios de PCR em tempo real foram usadas para a detecção no sistema de detecção ABI Prism Sequence 7900, com 40 ciclos de uma reacção (desnaturação a 95 ° C, emparelhamento e extensão a 60 ° C). quantificação absoluta foi usada para determinar de HPV16 e 18 carga viral, e o ADN genómico humano total na amostra foi determinada nas sequências Alu. diluições em série de ADN genómico humano e HPV16 comprimento total e 18 plasmídeos, de concentrações conhecidas, foram usados como curvas padrão
HPV16 E7 Primers
Forward:. CGGACAGAGCCCATTACAATATT
Reverso: CGCACAACCGAAGCGTAGA
HPV16 E7 Probe: TAACCTT (T /C) TGTTGCAAGTGT
HPV18 E7 Primers:
Forward: CCGACGAGCCGAACCA
Reverso: TGGCTTCACACTTACAACACATACA
HPV18 E7 Probe: AACGTCACACAATGTT
a fim de aumentar a eficiência de detecção do HPV, foi utilizada a multiplicar-ferrado rolando-circular técnica de amplificação (MP-RCA) para amplificar preferencialmente DNA HPV desconhecida, circular. MP-RCA foi demonstrada para amplificar modelos de DNA circular até 107 vezes [24]. O protocolo TempliPhi 100 estojo de amplificação (Amersham Biosciences) foi seguido.
O FAP PCR publicada protocolo foi seguido para detectar uma ampla gama de tipos de HPV em que os iniciadores foram desenvolvidos a partir de regiões conservadas de L1 [25]. Nós só realizada esta técnica em amostras de casos de câncer (Fig. 1). FIG. resulta 1 FAP PCR num gel de electroforese. Uma banda esperada de ~ 480 pb indica uma amostra positiva HPV
Categorizamos história de tabagismo da seguinte forma: não-fumante (0 packs); fumador de luz (& lt; 1pack /semana); fumante moderado (≥1pack /semana ≤1 bloco /dia); fumante pesado (≥1pack /dia). Para aqueles que fumavam charutos ou mastigados tabaco foram calculados para o equivalente de pacotes de cigarros fumados. história álcool foi categorizada como segue: none (nunca bebe); raramente /ocasionalmente (1 bebida a cada 1-2 meses); luz (1-6 bebidas /semana para fêmeas, 1-13 bebidas /semana para os homens); moderado (7 bebidas /semana para o sexo feminino, 14 bebidas /semana para os homens); pesados (& gt; 7drinks /semana para mulheres, & gt; 14 bebidas /semana para os homens)..
Todos os dados de análise foi feita usando Stata MP 13,1 (StataCorp LP, Texas, EUA)
Resultados
O câncer oral indivíduos com OPSCC e não OPSCC eram mais propensos a ser do sexo masculino do que indivíduos controle sem câncer, como pelo menos 83% dos indivíduos em cada tipo de câncer eram do sexo masculino, em comparação com apenas 46% dos controles (Tabela 1; p Art & lt; 0,001). casos de câncer, também eram mais velhos do que os controles, como & gt; 80% dos casos, independentemente do tipo de câncer, tinham 50 anos de idade ou mais, em comparação com apenas 63% dos controles (p
& lt; 0,001). Indivíduos com OPSCC e não OPSCC foram semelhantes aos indivíduos sem cancro com relação à raça (p
= 0,30) e etnia (p
= 0,62) e foram predominantemente caucasianos não-hispânicos. Aqueles que tiveram câncer (39% OPSCC, 54% não-OPSCC; p Art & lt; 0,001) eram mais propensos a ser fumantes pesados em comparação com aqueles sem câncer (32%). história pesado de álcool foi prevalente em 33% dos OPSCC e em 33% dos pacientes com tumores (p
= 0,015) em comparação com apenas 12% dos indivíduos não-cancerosas. uso de maconha foi observada principalmente em casos de câncer (11% OPSCC, 4% CEB; p
= 0,010) e raramente nos controles (0,91%). Casos de ambos os tipos de câncer (33% OPSCC, 33% não-OPSCC; p Art & lt; 0,001) foram mais propensos a ter HPV detectável do que controles saudáveis (0,9%) e, especificamente, digite 16 (25% OPSCC, 17% não OPSCC; p Art & lt; 0,001) detectada em suas amostras de lavagem oral em comparação aos controles. detecção de HPV18 não variam por grupo de estudo e foi detectado em uma única amostra de um indivíduo controle (p
= 0,63) e nenhum nos casos de câncer. Nosso método para detecção de HPV teve uma sensibilidade de 33% e especificidade de 99% (p Art & lt; 0,001) .able 1 Demografia entre todos os sujeitos em casos não-cancerosas e cancerosas
No câncer
OPSCC
não-OPSCC
p
-valor
n
= 110
n
= 76
n
= 24
Sexo
Masculino
51 (46,36%)
63 (82,89%)
20 (83,33%)
& lt; 0,001
Mulher 59 (53,64%)
13 (17,11%)
4 (16,67%)
idade Agrupados
20-39
27 ( 24,55%)
1 (1,32%)
1 (4,17%)
40-49
13 (11,82% )
10 (13,16%)
2 (8,33%)
50-59
21 (19,09%)
29 (38,16%)
11 (45,83%)
& lt; 0,001
60-69
29 (26,36%)
30 (39,47%)
8 (33,33%)
70 +
20 (18,18%)
6 (7,89%)
2 (8,3%)
Corrida
asiática
5 (5,55%)
Página 2 (2,63%)
1 (4.17)
preto
6 (5,45%)
1 ( 1,32%)
0
Branco
92 (83,64%)
65 (85,53%)
21 ( 87,50%)
0,30
Outros
7 (6,36%)
4 (5,26%)
1 ( 4,17%)
Desconhecido
0
4 (5,26%)
1 (4,17%)
Origem (Hispânico /Latino)
Sim
4 (3,64%)
2 (2,63%)
0
0,62
Sem
106 (96,36%)
74 (97,37%)
24 (100%)
A história do tabagismo
não-fumante
51 (46,36%)
21 (27,63%)
5 (20,83 %)
fumante Luz
1 (0,91%)
14 (18,42%)
2 (8,33%)
& lt; 0,001
Moderado fumante
23 (20,91%)
11 (14,47%)
4 (16,67 %)
fumante pesado
35 (31,82%)
30 (39,47%)
13 (54,17%)
história álcool
Nenhum
24 (21,82%)
7 (9,21%)
3 (12,50%)
Raramente /ocasionalmente
16 (14,55%)
14 (18,42%)
4 (16,67%)
Luz
54 (49,09%)
27 (35,53%)
9 (37,50%)
0,015
Moderado Sims 3 (2,73%)
3 (3,95%)
0
pesado
13 (11,82%)
25 (32,89%)
8 (33,33%)
Qualquer Marijuana usar
Sim
1 (0,91%)
8 (10,53%)
1 (4,17%)
0,010
No
109 (99,09%)
68 (89,47%)
23 (95,83%)
Qualquer HPV
1 (0,91%)
25 (32,89%)
8 (33,33%)
& lt; 0,001
HPV 16 positivos
0
19 (25,00%)
4 (16,67%)
& lt; 0,001
HPV 18 positivos
1 (0,91%)
0
0
0,63
ADATA para "Nenhum cancro" está associada com publicou dados de prevalência de HPV tipos 16 e 18 dentro de uma clínica estudante de odontologia definição
(J Dang et al.)
Vinte e duas amostras positivas de HPV foram testados para p16 antes da amostragem, e apenas um resultado negativo para p16 . No entanto, 26 amostras que foram negativas para HPV foram positivos para p16 (Tabela 2). Deve notar-se que três dos 26 pacientes (p = 0,085
) foram submetidos a tratamento (isto é. A quimioterapia, radioterapia, excisão) antes da amostragem, o que poderia afectar a presença de infecção pelo HPV antes. HPV foi marginalmente associada com a detecção de p16 (p = 0,076
); dos pacientes que eram HPV positivos, 96% teve um teste positivo p16; apenas uma amostra que foi positivo para HPV apresentaram resultados negativos para p16. Entre os pacientes negativos HPV, 79% eram p16 positivo. Apenas dois pacientes de casos tinha triagem HPV concluída antes da amostragem e ambos foram negativos para HPV em nossos testes eo screening.Table 2 p16 e qualquer HPV
Qualquer HPV
teste p16
p
-valor
positivo negativo
0,076
n
= 48
n
= 8
Sim
22 (95,65%)
1 (4,35%)
Não
26 (78,79%)
7 (21,21%)
Discussão
coleta da amostra do paciente pode ser uma tarefa difícil e demorado, especialmente quando o pesquisador é interromper um compromisso. Além disso, muitos indivíduos têm reflexos gag sensíveis, assim, se uma técnica de pincel ou cotonete é utilizado para raspar o fundo da garganta, a obtenção de uma amostra pode ser muito difícil sem o auxílio de um anestésico tópico. É por isso que é imperativo ter uma técnica de amostragem no lugar que é não-invasivo e rápido, mas suficiente para a detecção de HPV. Nosso estudo demonstrou que a coleta de amostra de lavagem oral é um método discreto de usar para detecção de HPV orais. Isto está em concordância com um estudo comparando lavagem oral e amostragem escova de citologia, que concluiu que enxaguatórios bucais foram a melhor escolha para a amostragem da cavidade oral, a fim de detectar para o HPV [26].
Usamos Scope® porque era observou-se que a preservação excelente qualidade de ADN de elevado peso molecular, e é mais aceitável do que a maioria dos outros meios de lavagem [27]. Quatro pacientes do grupo controle solicitado para enxaguar com Crest Pro-Health ® anti-séptico bucal não-alcoólicas. Nós não ver diferenças na quantidade de ADN (dados não mostrados), é necessário entretanto mais pesquisas para ver se há uma diferença com a quantidade bem como a qualidade.
A quantificação da carga viral pode ser crucial para determinar se OPSCC HPV-positivos /epidermóide estudados são, sem dúvida, o resultado da infecção pelo HPV [28]. O padrão-ouro para a avaliação da carga viral do HPV é PCR em tempo real [29, 30]. Um estudo demonstrou OPSCC ter uma carga virai de ~ 80.000 vezes mais elevada do que outros e CEB HNSCCs [29]. Nossos resultados não mostraram diferenças significativas entre os dois grupos de câncer (Fig. 2). Assim, as diferenças nos resultados poderiam ser devido aos autores utilizando biópsias fresco congelado em que apenas uma pequena parte da cavidade oral ou orofaringe é amostrados. amostras de lavagem oral pode permitir uma cobrança mais eficaz das células orais para a detecção do HPV. Variação dos achados garante uma investigação mais aprofundada da carga viral em associação com subconjuntos de CECP. FIG. 2 Comparação da carga viral de HPV16 (cópias /ng de ADN) entre os dois grupos do cancro. Não houve diferença estatisticamente significativa foi observada (p
= 0,40). As caixas cinzentas demonstrar gama de baixo para quartis superiores. A mediana é representado por uma linha horizontal. Os valores máximos e mínimos são indicados pelas linhas verticais. A carga viral variação entre cada grupo foi demonstrada. A carga viral média em OPSCC foi ligeiramente maior do que os casos não-OPSCC of the um paciente com OPSCC, que tinham sido submetidos a tratamento por 7 meses antes da amostragem, foi positivo para HPV, especificamente digite 16. Este caso é único, passando por vários mês de tratamento deve erradicar o vírus, a menos que se a infecção era recente. Deve notar-se que o paciente tinha uma história de fumar e beber pesado. Mais pesquisas sobre a prevalência da infecção pelo HPV após a radiação /quimioterapia é garantido.
Uma grande limitação foi não ter DNA a partir de tecido do tumor para comparar a detecção do HPV. As amostras de tecido não estavam disponíveis para nós, mas teria agido como um padrão-ouro em nosso estudo. Outras limitações do nosso estudo incluem: nossos resultados demonstram uma baixa sensibilidade para a detecção de HPV em pacientes com câncer, mas com uma especificidade muito elevada; não poderíamos controlar o quão bem um paciente gargarejo e agite o enxaguatório, o que terá um efeito sobre a quantidade e qualidade de DNA coletadas; Scope® tem um forte sabor a menta, o que pode não ser adequado para pessoas com bocas sensíveis; pequeno tamanho da amostra; não detectar de RNA HPV para mostrar infecção ativa; e FAP PCR é sensível o suficiente para detectar uma ampla gama de HPVs, mas alguns HPVs podem não ser detectados, devido à generalidade dos iniciadores desenhados [25]. testes
p16 normalmente só é realizado nos casos em que eles não se encaixam os fatores de risco tradicionais (ie. tabaco significativo e álcool histórico de uso) e teste de HPV raramente é feito. Isso é algo que precisa ser mudado durante o diagnóstico, devido ao aumento no OPSCCs associadas ao HPV.
Conclusões
De nossos resultados demonstramos que preferencialmente amplificado amostras de solução bucal com a detecção do HPV de real-time PCR Taqman e FAP PCR, é um método utilizável em geral, o que poderia ser usado no prazo de um ambiente clínico. Estudos mais específicos terão de ser feitos para determinar se lavagens de boca que realmente refletem, em casos, o tipo de HPV associado à lesão cancerosa
abreviações
CEB:. carcinoma de células escamosas oral
OPSCC: carcinoma de células escamosas da orofaringe
HNSCC:
Cabeça e pescoço de células escamosas carcinoma
RT-PCR:
reação em cadeia da polimerase em tempo real
FAP PCR:
fluorescente com primers arbitrários reação em cadeia da polimerase
MP-RCA:
Multiplique-ferrado amplificação rolling-circular
declarações
Agradecimentos
fonte de financiamento da Universidade do Fundo de Investigação Royalty de Washington
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concorrentes. interesses
os autores declaram que não têm interesses conflitantes. contribuições
dos autores
JD concluído todas as experiências, analisou todos os dados, e escreveu o manuscrito. NBK e QF concebeu /desenhou o estudo e avaliação /editou o manuscrito. KDE foi o oncologista colaborativa para o estudo que ajudou com recolha de amostras, e com a revisão /edição do papel. HJ assistida na coleta de amostras. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.
