Resumo
fundo
receptores de protease activados (PARs) são receptores acoplados à proteína com um papel activo na mediação da inflamação, dor e outras funções. O patógeno oral, Porphyromonas gingivalis
(P. gingivalis
) segrega proteases que ativam PARs. O objetivo deste estudo foi elucidar o papel dos PARs na patogênese da periodontite crônica através da análise de PARs em células humanas epiteliais (gengivais GECS) antes e depois P. gingivalis
tratamento sobrenadantes expressão.
Métodos
GECS foram isolados a partir de amostras de tecidos gengivais humanos saudáveis. A expressão de PARs em GECS foi determinada por reacção em cadeia com polimerase de transcrição reversa (RT-PCR) e citometria de fluxo. O efeito de P. gingivalis
proteases foi investigada por quantitativo em tempo real RT-PCR (qRT-PCR) e citometria de fluxo. Os resultados
PAR-1, de PAR-2, e PAR-3 foram expressas em GECS. PAR-4 não foi encontrado tanto por RT-PCR e citometria de fluxo. Análise da expressão do gene utilizando qRT-PCR revelou uma sobre-regulação de ARNm de PAR-2, em comparação com as células de controlo não tratadas (P
& lt; 0,05). Em contraste, as expressões de ARNm de PAR-1 e PAR-3 foram significativamente regulada para baixo (P
& gt; 0,05) em resposta a P. gingivalis
sobrenadante comparada com a de células de controlo não estimuladas. Este efeito foi anulada pelo TLCK inibidor de protease (P
& lt; 0,05). Os resultados de citometria de fluxo indicou níveis de proteína pars consistentes com os níveis de ARNm nos resultados de QRT-PCR.
Conclusões O presente estudo demonstra que PAR-1, de PAR-2 e PAR-3 são expressos em GECS. P. gingivalis
proteases desempenham um papel na regulação da resposta imune inata em GECS. GECS usar PARs para reconhecer P. gingivalis
e mediar as respostas das células envolvidas na imunidade inata. Receptores
Palavras-chave
Protease-activado células epiteliais gengivais humanos Porphyromonas gingivalis P
roteases Fundo
receptores protease-ativados (PARs) são uma subfamília de receptores acoplados à proteína G (GPCRs), com quatro membros, PAR-1, de PAR-2, PAR-3 e PAR-4, os quais desempenham papéis críticos na hemostase, a trombose, o desenvolvimento embrionário, cicatrização de feridas, inflamação e câncer de progressão [1]. A activação de PARs ocorre por um mecanismo único, que envolveu a clivagem proteolítica específica da sequência extracelular N-terminal por uma protease. Esta clivagem desmascara uma nova sequência N-terminal, que actua como um ligando amarrado que se liga ao receptor de dar início a cascatas de sinalização múltiplas [2-4]. Embora eles compartilham o mesmo mecanismo de acção, tem sido demonstrado que diferentes pars são caracterizados por diferentes distribuições e acções biológicas e podem ser activados por diferentes proteases [5]. A trombina é um importante activador de PAR-1, de PAR-2 e PAR-3. Outros activadores importantes do PAR-1 incluem a proteína C activada (APC) e metaloproteinase de matriz-1 (MMP-1); Considerando tripsina e triptase de mastócitos humanos ativar PAR-2 e tripsina e catepsina G ativar PAR-4. Em termos de induzir respostas de sinalização a jusante, PAR-1, de PAR-2 e de PAR-4 pode sinalizar de forma autónoma, enquanto PAR-3 é considerada principalmente para ser um co-receptor para o PAR-1 e PAR-4 [6-9]. Como PARs são expressos numa vasta variedade de tipos de células, recentemente, tem sido sugerido que elas desempenham papéis importantes em processos fisiológicos, tais como o crescimento, o desenvolvimento, a inflamação, reparação de tecidos e dor.
O epitélio gengival é tornar-se conhecido como um regulador da resposta imune inata por via oral para uma variedade de insultos, tais como bactérias e produtos químicos. células epiteliais gengivais humanos (GECS), que são fatores-chave da imunidade inata, não só desempenham um papel importante na manutenção da barreira física entre o hospedeiro eo ambiente, mas também participar activamente na imunidade tecido inata [10, 11] pelo especificamente expressando certa os receptores que estão envolvidos na resposta imune do hospedeiro. É amplamente aceito que as células utilizam receptores de reconhecimento de padrões para identificação de bactérias em seu ambiente [12, 13]; No entanto, além disso, alguns agentes patogénicos, tais como a Porphyromonas gingivalis
(P. gingivalis
), secretam proteases que são reconhecidos pelas células através da família de PARs [14]. PARs são conhecidos a ser expresso no epitélio da gengiva e têm sido implicados na patogénese da periodontite [15-18].
A periodontite é uma doença infecciosa crónica, que começa como uma inflamação dos tecidos periodontais e, finalmente, faz com que a reabsorção de osso alveolar e a subsequente perda de dentes. P. gingivalis
é um dos principais agentes causadores da periodontite crônica. Esta bactéria produz e libera uma grande quantidade de enzimas proteolíticas. proteinases tripsina, chamados gingipains, produzidos por P. gingivalis
foram mostrados para agir agentes patogênicos como importantes [19, 20]. Recentemente, tem sido mostrado que gingipains são reconhecidos pelas células através da família de PARs, que estão envolvidas em processos inflamatórios em diversos tecidos. No entanto, os papéis precisos de PARs em tecidos gengivais e a importância de PARs específicos na patogénese da periodontite permanecem por ser elucidados. No presente estudo, inverter reacção em cadeia de polimerase (RT-PCR) foi utilizado para investigar os níveis de mRNA de PARs e citometria de fluxo foi utilizada para investigar os níveis de proteína de PARs em GECS. Além disso, quantitativo em tempo real de RT-PCR (qRT-PCR) foi utilizado para investigar os níveis de mRNA de PARs em resposta ao sobrenadante isento de células a partir de P. gingivalis
para corroborar os papéis das proteases secretadas.
Métodos
cultura celular epitelial gengival
GECS primários humanos foram isolados de amostras de tecidos gengivais humanos saudáveis de pacientes submetidos a extração do terceiro molar no Departamento Dental, Sir Run Run Shaw Hospital, Faculdade de Medicina da Universidade de Zhejiang, na China. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os indivíduos que participaram deste estudo. O estudo foi avaliado e aprovado pelo Comitê de Ética da Affiliated Sir Run Run Mostrar Hospital de Zhejiang University School of Medicine (20.131.120). goma tecido fresco foi colocada em D-Hanks contendo 300 U /ml de penicilina G e 300 ug /ml de estreptomicina e incubou-se a 4 ° C. Dentro de 1 h, o tecido foi preparado para a obtenção de células epiteliais. Resumidamente, o tecido foi cortado em pequenos pedaços (1 mm x 1 mm), tratado com uma solução de 25% de dispase II (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) e incubados durante 18 h a 4 ° C. Após a incubação, a camada epidérmica de ceratinócitos humanos foi levantada a partir da derme e colocada num tubo de centrífuga estéril de 15 ml contendo 2 ml de tripsina-EDTA. O tecido foi incubado a 37 ° C durante aproximadamente 10 min. Posteriormente, isolado GECS foram semeadas em frascos T-75 (BD Biosciences) a uma densidade celular de cerca de 3 × 10
6 culas por frasco em 10-15 ml de meio de queratinócito isento de soro (de queratinócitos-SFM) para que os suplementos eram adicionado de acordo com as instruções do fabricante (Gibco BRL, Life Technologies, Rockville, MD, EUA). Fluidos nos frascos foram trocados por meio completo fresco e gaseados com 5% de CO 2 cada 2-3 dias. As células foram passadas quando 75-80% de confluência foi atingido.
Reverso análise de transcrição-PCR (RT-PCR) para a determinação de PARs expressão
Para examinar a expressão de ARNm de PAR, o ARN total foi isolado a partir GECS (crescida até à confluência de 70%) utilizando o reagente TRIzol ® (Gibco BRL, Life Technologies, Rockville, MD, EUA) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. A síntese da primeira cadeia de cDNA e por RT-PCR foram realizadas utilizando um Kit PromeScript® RT-PCR (Takara Biotecnologia Co., Ltd., Dalian, China). Os iniciadores para a PAR-1, de PAR-2, PAR-3, 4-PAR e β-actina foram sintetizados por Sangon Biotech Co., Ltd. (Xangai, China; Tabela 1). Para a amplificação de PAR-1, de PAR-2 e os produtos de p-actina, a PCR foi realizada durante 30 ciclos. O primeiro ciclo incluiu uma etapa de desnaturação de 5 min a 94 ° C. Ciclos 2-30 tinha um passo de desnaturação de 30 segundos a 94 ° C, 30 s de recozimento a 60 ° C e 45 s de alongamento a 72 ° C. O último ciclo incluiu uma etapa de alongamento de 10 min a 72 ° C. Para PAR-3 e PAR-4 amplificação, por PCR foi realizada durante 30 ciclos. O primeiro ciclo incluiu uma etapa de desnaturação de 5 min a 94 ° C. Ciclos 2-30 tinha um passo de desnaturação de 30 segundos a 94 ° C, 30 s de recozimento a 65 ° C e 45 s de alongamento a 72 ° C. O último ciclo incluiu uma etapa de alongamento de 10 min a 72 ° C. produtos de DNA e marcador de peso molecular DL1,000 ™ DNA marcador (Takara Biotechnology Co., Ltd, Dalian, China) foram separados em gel de agarose 1,5%, após o que os géis foram corados com GelRed ™ e visualizados sob UV light.Table 1 Oligonucle�ido sequências utilizadas para RT-PCR
Primers
sequência Oligonucle�ido
Comprimento (pb)
Sense (5 'para 3')
Antisense (5 'para 3')
PAR-1
CCCGCAGGCCAGAATCAAA
AAAGGGGAGCACAGACACAAACAG
395
PAR-2
CTACTCAGATGACCCCAGAAACT
CCCAAAGTGCTAGGATTACAGG
399
PAR-3
GGCTGGACAGGAGCCACGAT
AGCGGTTGATGCTGATGCAGG
403
PAR-4
GGATCGCCTACCACCTGCGTG
CCCGTAGCACAGCAGCATGG
401
β-actin
AGGGGCCGGACTCGTCATACT
GGCGGCAACACCATGTACCCT
202
cultura de bactérias e sobrenadantes coleção
P. gingivalis
ATCC 33277 foi adquirido da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA) e anaeróbia cultivadas (80% N 2, 10% H 2 e 10% de CO 2) em infusão cérebro-coração (BHI; Oxoid) em placa de ágar contendo 5% de sangue de carneiro desfibrinado enriquecido com 5 g de extracto /l de levedura, 5 mg /l de hemina e 10 mg /l de menadiona (Sigma -Aldrich, Dorset, Reino Unido) a 37 ° C durante até 5 semanas. As culturas liquidas foram preparadas por inoculação de colónias bacterianas (3-4 dias de idade) a partir de placas de agar de sangue para 10 ml de caldo BHI suplementado com 5 g de extracto /l de levedura, 5 mg /l de hemina e 10 mg /l de menadiona e incubou-se durante 24 h . Dez por cento de inoculo foi transferido para 90 ml do mesmo meio e incubou-se durante 6 dias. Após este período de cultura, as bactérias foram recolhidas por centrifugação a 10.000 g
durante 15 min a 4 ° C e os sobrenadantes foram recolhidos, esterilizada por filtração através de um filtro de 0,2 mm e armazenado a -80 ° C até à sua utilização. Antes do tratamento, foram usadas alíquotas do sobrenadante para pré-incubação (10 min) com 1 mmol /l de tosil-L-lisina clorometilcetona serina e cisteína protease inibidor (TLCK; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA), que inibe gingipains [15, 21].
Caracterização de sobrenadantes de culturas bacterianas e tratamento
P. gingivalis
sobrenadantes foram diluídos em meio de cultura de células e a sua concentração expressa como a proteína bacteriana total (mg /mL) presente nas culturas de células. A concentração de proteína foi determinada com um kit de ensaio de BCA Protein (Pierce, Rockford, IL, EUA). A absorvância foi medida a 562 nm num leitor de placas SpectraMax® Plus. a actividade da protease foi medida com um kit de Ensaio da Protease ™ (L-Biosciences, St Louis, MO, EUA) [22]. A absorvância do péptido marcado com corante foi medida a 570 nm para a determinação da actividade de protease. Quimicamente estabilizada tripsina (tripsina-MSG ™) foi fornecido com o kit como um padrão de protease geral. GECS foram cultivadas até à confluência de 80% e estimuladas com 50 ng /ml de proteína do sobrenadante da cultura de P. gingivalis
sobrenadantes ou sobrenadantes TLCK pré-incubadas, durante 6 h [22]. GEC forma não estimuladas serviram como controlo para as experiências de estimulação. Cada experiência de estimulação foi efectuada em triplicado e as células de dois a cinco dadores diferentes foram testadas.
Quantitativo em tempo real de RT-PCR (qRT-PCR)
Após a estimulação, o RNA total foi extraído usando um kit RNeasy (Qiagen, Valência, CA, EUA) e sujeitos a transcrição reversa usando um Kit de SuperScript® RT-PCR (Takara, Tóquio, Japão). Quantitativa em tempo real de RT-PCR foi realizada utilizando o aparelho de PCR da Applied Biosystems 7500 e kit SYBR Premix (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Os PCRs foram realizados em placas de 96 poços num volume total de 20 ul, incluindo iniciadores de ADNc e 0,8 uL de 1 ul (10 uM; Tabela 2). expressão das amostras foi normalizada contra a do gene de manutenção β-actina, que foi incluído em cada ensaio de QPCR. controlos de PCR foram realizadas usando água em vez de ADNc. Todas as reacções foram realizadas em duplicado. Em cada ponto de tempo, as expressões dos mRNAs seleccionados em células incubadas com o P. gingivalis
sobrenadantes ou sobrenadantes TLCK pré-incubadas foram calculadas em relação ao gene de manutenção β-actina (ôc
t) para cada uma das amostras e, em seguida, expresso em relação às células não tratadas no mesmo ponto de tempo utilizando o 2 -ΔΔC
t método [23] .table 2 sequências de oligonucleótidos utilizadas para qRT-PCR
produto do gene
Oligonucleótido sequência
Sense (5 'para 3')
Antisense (5 ' 3’)
PAR-1
GTGATTGGCAGTTTGGGTCT
GCCAGACAAGTGAAGGAAGC
PAR-2
CCTGGCCATGTACCTGATCT
GACACTTCGGCAAAGGAGAG
PAR-3
GGTGTGGGCAACAGTTTTCT
GGACTCGCAAGTGTTGTGAA
β-actin
AGGGGCCGGACTCGTCATACT
GGCGGCAACACCATGTACCCT
A citometria de fluxo
células foram lavadas em solução salina tamponada com fosfato (PBS), incubou-se durante 30 min a 4 ° C com PBS contendo 20% de soro humano normal inactivado pelo calor, lavou-se novamente e, em seguida, incubadas durante 30 min a 4 ° C com 15 nM de anticorpos monoclonais (mAb) específicos para PAR-1-4 humana (conjugado com PE; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, EUA). a citometria de fluxo análises foram realizadas num FACScan (BD Biosciences, San Jose ., as células de controlo CA, EUA) foram incubadas com anticorpos inespecíficos conjugado com PE obtidos a partir dos mesmos fabricantes foram usadas para definir o limiar para o parâmetro de fluorescência, de tal modo que a fracção de células com fluorescência positiva foi & lt; 2,5% do total de células. a percentagem de 1-4 PAR-células positivas foi determinada a partir da fracção de células na amostra incubada com os anticorpos específicos que excederam o limiar para a intensidade do sinal de fluorescência obtida com a amostra de controlo.
análise estatística Todos os dados são
mostrados como a média ± o desvio padrão (SD). dados QRT-PCR são expressos como C
t (limiar de ciclo), Sc
t (C
t PAR mRNA - C
t β- ARNm de actina) e quantificação relativa (RQ; expressa como alteração vezes). As mudanças vezes de expressão de mRNA PARs foram calculados utilizando o -ΔΔC
t método 2 [23]. t de Student
-test foi utilizado para comparação entre dois grupos. SPSS versão 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA) foi utilizado para análise estatística e P
≤ 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Resultados da análise dos PARs em GECS RT-PCR
RT análise-PCR de RNA extraído de GECS revelou a presença de PAR-1, de PAR-2 e ARNm de PAR-3 (Fig. 1). Nenhum produto de PCR foi encontrado para PAR-4 (Fig. 1). O resultado mostra que o PAR-1, de PAR-2 e PAR-3 são expressos em GECS, mas PAR-4 não é. FIG. Uma análise de RT-PCR de ARNm de PARs em GECS. RT-PCR foi realizada utilizando os iniciadores específicos para cada tipo de PAR, tal como descrito na Tabela 1. Os produtos de PCR foram sujeitos a electroforese através de um gel de agarose a 1,5%. Linhas 1-6 representam β-actina, PAR-4, PAR-3, PAR-2, PAR-1 e Marcador separadamente. A análise por RT-PCR revelou a presença de PAR-1, de PAR-2 e ARNm de PAR-3 em GECS. Nenhum produto da PCR foi encontrado para PAR-4
P. gingivalis
sobrenadante altera a expressão gênica PARs
A actividade proteolítica do sobrenadante de P. gingivalis
foi demonstrada após 4, 8 e 16 h. A pré-incubação do sobrenadante com o inibidor de protease TLCK mostraram significativamente reduzida actividade proteolítica comparada com a de sobrenadante nativa após 4 e 8 h (P
& lt; 0,05; Fig. 2). Para avaliar o efeito dos P. gingivalis
sobrenadante sobre a expressão de PAR-1, de PAR-2 e PAR-3 ARNm, GECS foram cultivadas até à confluência de 80% e estimuladas com o sobrenadante durante 6 h. Análise da expressão do gene utilizando qRT-PCR mostrou sobre-regulação de ARNm de PAR-2, em comparação com células de controlo não tratadas (P
& lt; 0,05; Fig. 3b). Em contraste, as expressões de ARNm de PAR-1 e PAR-3 foram significativamente regulada negativamente (P
& lt; 0,05) em resposta a P. gingivalis
sobrenadante em comparação com a das células de controlo não estimuladas (Fig. 3a, c) . A pré-incubação das P. gingivalis
sobrenadante com o inibidor de protease TLCK aboliu o efeito restaurado e os níveis de expressão de ARNm de PARs com a das células não tratadas. Controlos estabelecem utilizando meio bacteriana em branco e TLCK não mostrou qualquer efeito sobre a expressão de ARNm de PAR-1, de PAR-2 e PAR-3 (Fig. 3). Os resultados foram consistentes com estudos anteriores [22]. FIG. 2 As atividades de protease de P. gingivalis
sobrenadante ou sobrenadante TLCK pré-incubadas. a actividade da protease foi medida com um kit de Ensaio da Protease ™ e foi monitorizada durante 4, 8 e 16 h. A absorvância do péptido marcado com corante foi medida a 570 nm para a determinação da actividade de protease. sobrenadante nativa mostrou aumento significativo da actividade proteolítica de sobrenadante TLCK-pré-incubados após 4 e 8 h. as medições foram realizadas em triplicado. Os dados são apresentados como a média com o desvio padrão (média ± DP). *, P Art & lt; 0,05, em comparação com os valores de sobrenadante nativos
Fig. 3 PAR-1 (um), PAR-2 (b) e PAR-3 (c) expressão dos genes em resposta a P. gingivalis
sobrenadante. a expressão do gene foi avaliada por PARs quantitativo em tempo real de RT-PCR (qRT-PCR), em resposta ao sobrenadante isento de células a partir de P. gingivalis e
sobrenadante TLCK pré-incubadas em GECS. Depois de P. gingivalis
tratamento sobrenadante, a expressão de PAR-2 foi regulada positivamente em comparação com células de controlo não tratadas. Por outro lado, PAR-1 e PAR-3 expressão foi significativamente reprimidos. Os dados são apresentados como a média com o desvio padrão (média ± DP). *, P Art & lt; 0,05, em comparação com os valores de controlo. Controle: sem estimulação sobrenadante. P. gingivalis
S: P. gingivalis
sobrenadante
Pars expressão da proteína avaliada por citometria de fluxo
citometria de fluxo mostraram expressão da proteína de PAR-1, PAR-2 e PAR-3 por GECS, mas nenhuma PAR-4 de expressão (Fig. 4). Depois de P. gingivalis
tratamento sobrenadante durante 6 h, a expressão da proteína de PAR-2 foi regulada positivamente em comparação com células de controlo não tratadas (P
& lt; 0,05; Fig. 5). Por outro lado, os níveis de proteína de PAR-1 e PAR-3 foram regulados negativamente de forma significativa após o tratamento (P
& lt; 0,05). Os resultados de citometria de fluxo indicou níveis de proteína pars consistentes com os níveis de ARNm nos resultados de qRT-PCR. FIG. nível 4 Proteína de PARs em GECS por citometria de fluxo. a, b, c e d mostram resultados representativos das análises de citometria de fluxo de PAR-1, de PAR-2, PAR-3 e PAR-4, respectivamente. O resultado mostrou GECS expressa PAR-1, PAR-2 e PAR-3, mas não PAR-4. linha preta: controlo de isotipo. Linha Verde: anti-PARs
Fig. 5 PAR-1 (um), PAR-2 (b) e PAR-3 (c) a expressão da proteína em resposta a P. gingivalis
sobrenadante. PARs expressão foi avaliada por citometria de fluxo em resposta ao sobrenadante isento de células a partir de P. gingivalis e
sobrenadante TLCK pré-incubadas em GECS. A citometria de fluxo análises foram realizadas num FACScan. Depois de P. gingivalis
tratamento sobrenadante durante 6 h, a expressão de PAR-2 foi regulada positivamente em comparação com células de controlo não tratadas. Por outro lado, PAR-1 e PAR-3 de expressão foi significativamente regulada negativamente após o tratamento. Os dados são apresentados como a média com o desvio padrão (média ± DP). *, P Art & lt; 0,05, em comparação com os valores de controlo. Controle: sem estimulação sobrenadante. P. gingivalis
S: P. gingivalis
sobrenadante
Discussão A periodontite é uma infecção dos tecidos periodontais que são a estrutura de suporte para os dentes. Na estrutura complexa de tecidos periodontais, epitélio gengival está directamente exposta a bactérias periodontais e seus produtos, por receber e transmitir sinais, desempenha um papel importante no diálogo geral que ocorre entre agentes patogénicos e o anfitrião. PARs são expressos e função em GECS como uma parte do sistema de imuno-vigilância. Estes receptores são claramente importantes para respostas GECS para o meio ambiente que podem incluir produtos patogénicos ou fisiológicas.
Quatro membros da família (PAR-1, -2, -3, e -4) foram identificadas até agora. Neste estudo mostramos que PAR-1, de PAR-2 e PAR-3 são expressos em GECS, mas PAR-4 não é expressa em GECS. Muitos investigadores já relataram a expressão de PARs em uma ampla variedade de tipos de células, enquanto que houve controvérsia sobre a expressão de PARs [2, 3, 13, 17]. Existem também alguns estudos sobre a expressão de PARs em GECS, mas a maioria dos estudos foram em causa sobre a expressão e os papéis de PAR-2. A sobre-expressão de PAR-2 foi positivamente associado com parâmetros clínicos inflamatórias e com os níveis de interleucina-6 (IL-6), IL-8, factor de necrose tumoral alfa, matriz metaloprotease-2 (MMP-2), MMP-8, factor de crescimento de hepatócitos e factor de crescimento endotelial vascular [5, 24, 25]. Apenas uma investigação descobriu PAR-1, de PAR-2 e PAR-3 de expressão em células KB por RT-PCR e PAR-1, de PAR-2 e de expressão de PAR-3 em GECS por estudos imuno-histoquímicos [17]. No nosso estudo, a RT-PCR e citometria de fluxo foram utilizados para analisar a expressão de PARs. Os resultados foram corroborados o PAR-1, de PAR-2 e de expressão de PAR-3 em GECS. Online em epitélio gengival, cisteína proteases específicas de arginina (Arg-gingipain, RGP) a partir de P. gingivalis
, um importante agente patogénico associado com periodontite crônica, ative PARs e induzir a expressão de citocinas inflamatórias [22, 26, 27]. A família PAR é estruturalmente não relacionado com a família de receptores de reconhecimento de padrões (PRR), mas, como PRRs, eles sinalizam perigo em potencial no ambiente, ativando marcadores da imunidade inata e respostas inflamatórias [28]. No entanto, pouco é conhecido sobre as suas funções, quando são activados por enzimas sua agonistas, a trombina e tripsina ou enzimas semelhantes a tripsina, em epitélio gengival. PARs são expressas por uma ampla variedade de tipos de células e são sugeridos para desempenhar papéis importantes em processos fisiológicos, tais como o crescimento, o desenvolvimento, a inflamação, reparação de tecidos e dor [29]. O estudo demonstrou que a expressão de PAR-2 foi regulada positivamente com P. gingivalis
tratamento sobrenadante em comparação com células de controlo não tratadas. Por outro lado, PAR-1 e PAR-3 expressão foi significativamente reprimidos, depois de P. gingivalis
tratamento sobrenadante. De facto, a activação de PAR-2 tem sido associada com diversas condições inflamatórias crónicas [3, 30-32]. Além disso, in vitro e in vivo em estudos têm sugerido que claramente PAR-2, também desempenha um papel na inflamação periodontal [15, 16, 33, 34]. PAR-1 activação, através de trombina ou activação de péptidos de origem humana, tem sido implicado como um regulador potencial da dor e inflamação [35-37]. Um estudo recente mostrou que também PAR-1 foi expresso em tecidos gengivais [18] e de activação de PAR-1 pela trombina pode desempenhar um papel na reparação e na homeostase dos tecidos periodontais [38]. O papel de PAR-3 é de interesse porque a função deste receptor aparentemente sem sinalização permanece obscura [9, 39, 40]. A capacidade de PAR-3 para gerar um sinal intracelular, também permanece em dúvida porque lhe falta o domínio cauda citoplasmática mostrado em outros PARs, que é necessário para acoplar com proteínas-G [9]. Um estudo recente demonstrou que o PAR-3 é um determinante crítico do PAR-1 e PAR-função 3 podem mitigar os efeitos do PAR-1 na activação de respostas endoteliais, tais como inflamação vascular [41]. PAR-3 regula a sinalização PAR1 por dimerização do receptor. Tem havido controvérsia sobre o papel dos PARs. Em alguns tecidos, elas desempenham um papel proinflamatório [42], enquanto que em outros tecidos que parecem ter um efeito anti-inflamatório ou de protecção [43]. Esta função protectora pode ser facilitada pela regulação positiva do PAR-2 e a regulação negativa do PAR-1 e PAR-3 a expressão do gene em resposta a P. gingivalis
proteases. No entanto, mais estudos são necessários para elucidar totalmente as funções de PAR-1, PAR-2, e PAR-3 na patogênese da periodontite.
Conclusões
O estudo aqui descrito confirma os papéis de PAR-1, PAR -2 e PAR-3 em respostas epiteliais gengivais que podem estar relacionados à inflamação periodontal. Consequentemente, os mecanismos detalhados subjacentes aos efeitos mediados pelos principais PARs em periodontite, incluindo a sua correlação com citocinas, exigem mais investigação. Esta informação irá proporcionar uma melhor compreensão do desenvolvimento de doenças periodontais e informar a estratégia para a identificação de abordagens terapêuticas para estas condições.
Declarações
Agradecimentos
Agradecemos aos dentistas (departamento Dental, Sir Run Run Shaw Hospital da Faculdade de Medicina, Universidade de Zhejiang) para a sua assistência. Agradecemos ao Dr. Yu Yunsong e sua equipe de pesquisa (Departamento de Doenças Infecciosas, Sir Run Run Mostrar Hospital, Faculdade de Medicina da Universidade de Zhejiang) por seu apoio técnico. Este trabalho foi apoiado por subsídios da National Science Foundation Natural da China (N.º 81.000.447)
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concorrentes. interesses
Os autores declaram que não têm interesse competindo. contribuições
dos autores
Dr. Zhang realizados os experimentos e escreveu o manuscrito. Dr. Li estava no comando da coleção de tecidos gengivais. Hu ajudou a executar as experiências. Dr. Sheng foi responsável pela análise de dados. Prof. Chen concebido e desenhado os experimentos. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.
