oral humana da arte abstracta
Fundo
placa formada nas superfícies dos dentes é um ecossistema complexo composto por diversas bactérias orais e componentes salivares. Acúmulo de placa bacteriana é um fator de risco para cárie dentária e doenças periodontais. L-arginina tem sido relatado para reduzir o risco de cáries dentárias, elevando o pH da placa através da actividade de desiminase de arginina em bactérias orais. Neste estudo foi avaliado o potencial de L-arginina para remover biofilmes orais estabelecidas.
Métodos
biofilmes foram formadas usando saliva humana misturada com caldo de infusão de cérebro e coração suplementado com 1% de sacarose em placas multi-poços ou em discos de plástico. Após a lavagem dos biofilmes com solução salina, citrato (10 mM, pH 3,5), ou L-arginina (0,5 M, pH 3,5), os biofilmes retidos foram analisados por coloração com violeta de cristal, a microscopia electrónica de varrimento, e com base Ilumina-16S ADNr de sequenciação.
resultados da lavagem com ácido L-arginina biofilmes orais separadas de forma mais eficiente do que o soro fisiológico e significativamente reduzida massa de biofilme retidas em placas de multi-poços ou em discos de plástico. análise microbiota baseada em Illumina mostrou que o citrato (pH 3,5), preferencialmente lavadas Streptococcus
de biofilme bucal madura, enquanto ácido L-arginina preparado com 10 mM tampão citrato (pH 3,5) não especificamente removido componentes microbianos da via oral biofilme.
Conclusões
ácida L-arginina preparado com tampão citrato (pH 3,5) efetivamente desestabilizado e removidos biofilmes orais maduros. A solução de L-arginina ácido descrito aqui pode ser utilizado como um aditivo que aumenta a eficácia da boca lavagens utilizados na higiene oral.
Palavra-chave
L-arginina biofilme lavar a boca microbiota oral material suplementar Saliva A linha Electrónicas | versão deste artigo (doi:. 10 1186 /s12903-016-0194-z). contém material suplementar, que está disponível para usuários autorizados
Fundo
Há evidências de que a deterioração da higiene bucal está associada doença periodontal com [1], bem como o risco aumentado de doença cardiovascular [2, 3], síndrome metabólica [4, 5], e o nascimento pré-termo [6]. cuidados de higiene oral também é reconhecida como uma medida fundamental que reduz os riscos de pneumonia aos cuidados de saúde associados (PACS). biofilmes orais podem actuar como reservatórios para bactérias por pneumonia, tal como sugerido pela semelhança entre microbiota oral e amostras clínicas PACS [7-9]. Muitos ensaios clínicos que investigaram a eficácia dos cuidados de higiene oral na profilaxia para PACS, incluindo pneumonia decorrente de ventilação mecânica, foram relatados. Estes ensaios encontradas: (i) as medidas de higiene oral mecânica e química reduzida a taxa de colonização patogénio respiratório na microbiota oral [10, 11]; (Ii) cuidados de higiene bucal ou com clorexidina ou gel foi associada com uma redução de 40% na pneumonia associada à ventilação mecânica em adultos criticamente doentes [12]; e (iii) a limpeza bucal mecânica reduziu significativamente o risco de pneumonia fatal [13].
cavidades oral contêm diversa microbiota que os números quase 700 espécies [14]. Este ecossistema inclui bactérias formadoras de biofilmes como Streptococcus mutans
, Fusobacterium nucleatum
, Porphyromonas gingivalis
e Aggregatibacter actinomycetemcomitans
. Embora a microbiota varia entre os indivíduos, dentro de um determinado indivíduo a microbiota oral é relativamente estável [15]. No entanto, a composição microbiana oral, podem mudar rapidamente em condições comprometidos que podem ocorrer durante as hospitalizações [16]. Portanto, cuidados de higiene bucal para pacientes criticamente enfermos é especialmente importante para prevenir a colonização de bactérias resistentes a múltiplas drogas ou crescimento excessivo de patógenos respiratórios. higiene oral inadequada pode resultar na formação de placa dentária maduro nas superfícies dos dentes ou células epiteliais bucais, e essa placa pode ser resistente à limpeza por lavagem com água ou mesmo com escovas de dentes manual, o que realça a necessidade de estratégias eficazes que suprimem biofilme bucal formação. Vários ensaios para testar a capacidade de extratos de ervas [17], desinfetantes [18, 19], inibidores da produção de polissacarídeo [20, 21], e açúcares raros [22] para reduzir a formação de biofilmes orais foram realizados.
Recentemente , agentes alcalinos, tais como geradores de L-arginina e ureia foram previstos para inibir o crescimento de bactérias ou acidogênicas aciduric por aumento do pH do ambiente oral [23]. O metabolismo da L-arginina e de ureia por arginina desiminase e urease, respectivamente, produz amónia. Muitas bactérias orais possuem um sistema de arginina desiminase, que metaboliza L-arginina e ornitina para produzir amoníaco, que aumenta o pH de biofilmes orais. Os ensaios clínicos que investigam-L-arginina contendo dentífricos ou lavagens de boca mostraram um efeito protetor contra o desenvolvimento de cárie dentária em indivíduos jovens [24, 25]. Além disso, a L-arginina e fluoreto sinergicamente suprimida S. mutans
crescimento e formação de biofilme [26].
L-arginina é um aminoácido básico que contenha um grupo de guanidina. Tal como cloridrato de guanidina, de L-arginina pode aumentar a solubilidade da proteína e suprimir a agregação da proteína [27]. Embora o mecanismo preciso para a inibição de L-mediada por arginina de interacções proteína-proteína ainda não está claro, a L-arginina pode alterar as tensões superficiais das proteínas por interacção com as proteínas ou a água circundante-los sem o anexo apertado observado com outros agentes, tais como cloridrato de guanidina [28]. Uma vez que esta interacção leve preserva as funções das proteínas, L-arginina tem sido utilizada para a solubilização de proteínas expressas de forma exógena ou anticorpos para utilização farmacêutica. Além disso, a L-arginina foi recentemente relatado para diminuir a infecciosidade de vírus de envelope, tais como o vírus do herpes simplex e vírus da gripe, provavelmente devido ao comprometimento da função de proteínas no envelope [29].
Biofilme oral é um complexo que é ecossistema composto por diversas bactérias, glucano insolúvel, e glicoproteínas salivares. A remoção desta placa biológica sólida das superfícies dos dentes através de uma simples lavagem com água ou até mesmo com a escovação mecânica pode ser difícil. placa residual também serve como uma base para posterior formação de biofilme. Uma vez que a L-arginina é esperado para inibir a formação de biofilme oral e também destabilizar agregados complexos na placa dentária, a inclusão deste aminoácido em uma lavagem bucal que poderia facilitar a remoção do biofilme oral. Neste estudo, avaliou-se o potencial de L-arginina como um limpador para remover biofilmes orais já estabelecidas.
Métodos
Killing ensaio para Streptococcus mutans
glicerol estoques de S. mutans
GS5 foram semeadas em Brain Heart Infusion (BHI) placas de agar que foram em seguida incubadas anaerobicamente a 37 ° C durante 48 h. cultura anaeróbia foi realizada utilizando um sistema de AnaeroPack (Mitsubishi Gas Co., Ltd.). Várias colónias de S. mutans
GS5 foram inoculadas em caldo BHI e cultivada a 37 ° C durante 48 h. As culturas foram centrifugadas a 15000 rpm durante 5 min e ressuspensos em solução salina. As suspensões bacterianas (0,1 ml) foram adicionados a 0,9 ml de solução salina, citrato 10 mM (pH 3,5), ou 0,5 M de L-arginina em citrato 10 mM (pH 3,5). Após incubação durante 5 min a 37 ° C, foram preparadas diluições em série de 10 vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4), e 0,1 ml de uma diluição adequada foi espalhado em placas de agar BHI. Após uma incubação anaeróbia 72 h a 37 ° C, o número de colónias foi contado e comparado com o número no tratamento de solução salina.
Biofilme ensaio de inibição
Para avaliar o efeito inibidor sobre a S. mutans
GS5 biofilme formação, 0,1 ml de solução salina, citrato 10 mM (pH 3,5), 0,5 M ou pH3.5-7.0 L-arginina (ajustado por 10mM de tampão de citrato) foram misturados com um volume igual da suspensão bacteriana (1% v /v de cultura de 48 h) em 2 x BHI contendo 2% de sacarose. As misturas foram adicionadas a placas de 96 poços e incubou-se anaerobicamente a 37 ° C. Após uma cultura de 24 h, os biofilmes formados sobre o fundo dos poços foram quantificadas por coloração com violeta de cristal tal como descrito abaixo.
Recolha de amostras salivares humanas
Após consentimento informado por escrito foram obtidos a partir de nove voluntários saudáveis (21-27 anos de idade , do sexo masculino), eles foram convidados a recolher saliva excretada enquanto a goma de mascar de cera para 5 min. Os critérios de exclusão eram menores de 20 anos de idade ou ter recebido tratamento com antibióticos nas últimas 4 semanas.
efeito de limpeza de L-arginina no biofilme bucal formado em discos de plástico
biofilmes orais humanos foram formados em discos de plástico estéril 13,5 mm (Sensi-Disc, Sumitomo Bakelite, Co., Ltd., Tóquio), fixado em 24 poços placas de cultura. Os discos foram incubados em 0,5 ml de BHI contendo 1% de sacarose e 20% de saliva humano recolhido de três voluntários saudáveis (# 1- # 3). Depois de um cultivo anaeróbico 72 h, os discos foram removidos e lavados uma vez com solução salina. Os biofilmes sobre os discos foram adicionalmente lavadas com 0,5 ml de citrato 10 mM (pH 3,5), 0,5 M de cada um de L-arginina, L-alanina, L-glicina ou L-lisina (todos ajustado o pH a 3,5 por 10 mM citrato) por agitação durante 30 min a 37 ° C. Os discos foram, em seguida, lavou-se novamente com 0,5 mL de PBS (pH 7,4), coradas com 0,5 ml de 0,01% de violeta de cristal durante 20 minutos à temperatura ambiente. Os discos foram então lavadas quatro vezes com 1,0 ml de solução salina e secou-se ao ar. Depois de tirar a fotografia, o corante remanescente foi eluída com ácido acético 0,5 ml de 33% por agitação durante 30 min à temperatura ambiente. A absorvância dos eluentes a 550 nm foi então medida.
Ensaio de limpeza no biofilme salivar humana utilizando micropoços
saliva humana recolhidas a partir de quatro voluntários saudáveis (# 4- # 7) foram adicionados a BHI contendo 1% de sacarose a 20 % (v /v). biofilmes orais humanos modificados foram também preparados pela adição de 48 h de S. mutans
culturas GS5 (1% de volume final) para simular biofilme cariogénicos. Cada mistura (0,1 ml) foi então adicionada a placas de 96 poços e incubou-se anaerobicamente a 37 ° C. Após 72 h, as culturas foram removidos, e o biofilme formado na parte inferior das placas foi lavada uma vez com 0,2 ml de solução salina. Cada poço foi em seguida lavada com 0,1 ml de solução salina (controlo), citrato 10 mM (pH 3,5, o solvente para a L-arginina no presente estudo), ou 0,5 M de L-arginina (pH 3,5) por agitação durante 30 min a 37 ° C. Os reagentes de teste foram decantadas e cada poço foi lavado três vezes com 0,2 ml de solução salina. O biofilme remanescente foi corado com 0,1 ml de 0,01% de violeta de cristal durante 20 minutos à temperatura ambiente. Após a coloração, as cavidades foram lavadas quatro vezes com 0,2 ml de solução salina, e o corante remanescente foi eluída com ácido acético 0,2 ml de 33% por agitação durante 30 min à temperatura ambiente. Mediu-se então a absorvância dos eluentes a 550 nm. Seis cavidades foram usadas para cada amostra num único ensaio. Os ensaios foram repetidos três vezes de forma independente. Microscopia electrónica de digitalização
biofilme oral humana foram formados em discos de plástico estéreis de 13,5 mm, utilizando as amostras de # 4 a # 7. Os discos foram incubados em 0,5 ml de BHI contendo 1% de sacarose e 20% de saliva humana. Depois de um cultivo anaeróbico 72 h, os discos foram removidos e lavados uma vez com solução salina. Os biofilmes sobre os discos foram adicionalmente lavadas com 0,5 ml de solução salina, citrato 10 mM (pH 3,5), ou 0,5 M de L-arginina (pH 3,5) por agitação durante 30 min a 37 ° C. Os discos foram, em seguida, lavou-se novamente com 0,5 mL de PBS (pH 7,4), e os biofilmes sobre os discos foram fixados com glutaraldeído a 2% em tampão cacodilato 0,1 M (pH 7,2). Após a fixação, os biofilmes foram desidratados numa série graduada de etanol e secou-se num aparelho de secagem de ponto crítico Hitachi PCP-2. Os discos foram revestidas com platina /paládio em um Hitachi E-102 sputter coater e examinadas com um microscópio eletrônico de varredura JEOL JCM-6000. A área de biofilme retidos após a lavagem com cada reagente teste foi medido utilizando a ferramenta de seleção automática de cores no Photoshop CS6. Os rácios de valor de pixel da área de biofilme para a área total de observação foram calculados a partir de cinco campos selecionados aleatoriamente em 100x.
Análise da composição microbiana por 16S rDNA
O microbioma salivar dos seis voluntários saudáveis (# 4 # 9 ) foi caracterizada pela Illumina Miseq 16S rDNA análise de sequenciação de DNA extraído de 3 ml de saliva. Para identificar os grupos microbianos que eram sensíveis ao citrato ou L-arginina enxaguamento, biofilmes derivado de saliva humana, formados em discos de plástico de 13,5 mm foram lavadas com os reagentes de teste acima descritos. Os reagentes de teste foram depois recuperados, e as bactérias das lavagens foram recolhidos por (fração desbotada) centrifugação. Os discos foram lavados três vezes com 0,5 ml de solução salina, cortado em pedaços com uma tesoura estéreis, e, em seguida, transferidos para 0,5 ml de solução salina por sonicação com um Bioruptor (Cosmobio, 3 x 1 min com intervalo de 1 min, ajustando saída H). Os biofilmes isoladas foram recolhidas por centrifugação (fracção sustentada). DNA de ambas as fracções foi também purificado e a composição microbiana determinada por análise de sequenciação de 16S ADNr.
Extracção de ADN foi realizada de acordo com o método relatado por Morita et ai. [30]. bibliotecas de sequenciação foram preparadas por amplificação região V3-V4 do ADNr 16S, utilizando os iniciadores descritos por Klindworth et ai. [31]. Após a amplificação inicial, uma segunda PCR foi realizada para ligar adaptadores Illumina, bem como os códigos de barras que são permitidos para a multiplexação. As amplificações foram realizadas em reacções de 25 ul contendo 2,5 uL modelo diluído, 12,5 ul 2x KAPA HiFi Ready Mix HotStart e 2,5 pi de cada iniciador. ciclos térmicos consistiram em um passo de desnaturação inicial (3 min a 95 ° C), seguido por 25 ciclos de desnaturação (30 s a 95 ° C), emparelhamento (30 s a 55 ° C) e extensão de 30 s a 72 ° C. O passo de extensão final foi de 5 min a 72 ° C. Amplicons foram purificados usando esferas AMPure XP (Beckman Coulter). A sequenciação foi efectuada na plataforma Illumina MiSeq (Kit de Reagentes MiSeq Ver. 3, 600 ciclos) de acordo com as especificações do fabricante para gerar emparelhado-fim lê de 300 bases em cada direcção. Um total de 2 x 10381210 300 pares de bases lê com uma média de 432.550 leituras por amostra foi obtida. As sequências dos iniciadores foram aparadas, ea ponta emparelhado lê mescladas usando Fastq-se juntar [32] com os parâmetros predefinidos e processadas com o gasoduto QIIME 1.8.0 [33]. Após uma verificação quimera por Usearch, 20.000 Illumina leituras por amostra (pontuação média em qualidade acima de 20) foram selecionados aleatoriamente para análise posterior. Usando o UCLUST [34] algoritmo construído no gasoduto QIIME, as sequências foram agrupadas em & gt; 97% de identidade no banco de dados de referência Greengenes, produzindo 635 unidades taxonômicas operacionais (Otus). Usando o gasoduto QIIME, distâncias UniFrac não ponderadas foram produzidos e utilizados para investigar a diversidade beta traçando PCA coordenadas Os dados da seqüência
Nucleotide seqeunce
tenham sido depositados na base de dados DDBJ (número de acesso: DRA004109, PRJDB4298, SAMD00042426-SAMD00042441).. estatísticas
a análise estatística dos dados foi realizada com StatFlex ver. 6.0 (Artech Co., Ltd., Tóquio), utilizando análise de variância (ANOVA) para comparar as médias de todos os grupos e seguido pelo teste de Tukey para comparar as médias de cada um dos dois grupos. Os dados foram considerados significativamente diferente se o valor p Página 2 de cauda foi inferior a 0,05.
Consentimento Ética e permissões
saliva humana foram coletadas de nove voluntários saudáveis após foi obtido consentimento informado por escrito. A aprovação ética foi obtida do Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina da Universidade de Kagawa (número de referência, 27-074).
consentimento para publicar
Os autores obtiveram o consentimento de todos os participantes para publicar os dados de análise sob anonimato linkable.
resultados
efeito inibidor de L-arginina em S. mutans
formação de biofilme GS5
ensaios de biofilme foram realizados para determinar o efeito da L-arginina sobre S. mutans
GS5 biofilme formação em condições de pH variando de ácido para neutro (pH3.5-7.0). Em primeiro lugar, a cultura de S. mutans
GS5 foi adicionada a 2 x BHI contendo 2% de sacarose a 2% (v /v). A suspensão bacteriana (0,1 ml) foi, em seguida, misturado com solução salina, citrato 10 mM (pH 3,5) ou 0,5 M de cada um de solução de L-arginina ajustado o seu pH (3,5-7,0) e aplicadas aos micropoços. Após 24 h de cultivo anaeróbico, S. mutans
biofilme foi quantificado por coloração com cristal violeta. Como mostrado na Fig. 1, as soluções de L-arginina (concentração final, 0,25 M), que foram ajustadas para pH 3,5 inibiu significativamente S. mutans
biofilme após 24 h de cultivo, quando comparado com uma solução salina ou tampão de controlo (citrato 5 mM, pH 3,5) . O efeito de L-arginina era dependente do pH, em que apenas as soluções de L-arginina a pH 3,5 ajustado a formação de biofilme significativamente inibida. Além disso, esta inibição era improvável que seja devido a um efeito bactericida, porque 10 mM de tampão de citrato (pH 3,5) e L-arginina a pH 3,5 ajustado reduzida S. mutans
número de GS5 de apenas 0,61 ± 0,30 e 0,49 ± 0,22 log
10 CFU /ml durante um contacto de 5 min, respectivamente, e a densidade óptica dos S. mutans
cultura após 24 horas de incubação não foi diferente entre as amostras com e sem 0,25 M de solução de L-arginina (pH 3,5). Estes resultados sugerem que o ácido L-arginina desestabilizado estrutura do biofilme e /ou redução da produção de glucano insolúvel de S. mutans
. Com base nestes resultados, as soluções de L-arginina acídicos é ajustada para pH 3,5 foram utilizados para análises subsequentes. FIG. Uma inibição de S. mutans dependente do pH
GS5 formação de biofilme por L-arginina. Diluído S. mutans
culturas GS5 e reagentes de teste foram misturados em 1: 1. Após as misturas foram cultivadas anaerobicamente a 37 ° C durante 24 h, S. mutans
biofilmes que se tinham formado na parte inferior dos micropoços foram quantificadas por coloração com violeta de cristal. Solução salina (S), 10 mM de pH 3,5 de citrato de (CA3.5) ou 0,5 M de solução de L-arginina ajustado com tampão citrato 10 mM a um pH entre 3,5 e 7,0 (indicado como LA3.5-LA7.0) foram usadas como Os reagentes de teste. Os dados estão expressos como média ± desvio padrão. * Significativamente diferente de solução salina (p
& lt; 0,05), ** Significativamente diferente do citrato 10 mM (pH 3,5) (p
& lt; 0,05)
efeito de limpeza da solução de ácido L-amino no bucal biofilme
biofilme derivado de saliva foi preparado em discos de plástico usando as amostras de saliva de adultos saudáveis (# 1, # 2, e # 3). Após o biofilme foi lavada com citrato 10 mM (pH 3,5), 0,5 M de cada um de L-arginina, L-glicina, L-lisina ou soluções de L-alanina, que foi ajustado o pH para 3,5. Como mostrado na Fig. 2a, as manchas de cristal violeta em os discos foram lavados com L-arginina tinham menos do que os lavados com tampão de citrato ou outros três L-aminoácidos testadas. Os corantes violeta de cristal foram eluídos com ácido acético, e a absorvância a 550 nm da eluição foi medida para quantificar os biofilmes de retenção sobre os discos. Como mostrado na Fig. 2b, a L-arginina reduzida biofilme salivar humana de forma mais eficaz do que outros aminoácidos L embora não foi observada diferença significativa. FIG. 2 efeito de limpeza de L-arginina no biofilme formado salivar em discos de plástico. uma coloração violeta de cristal do biofilme retenção nos discos após a lavagem. O biofilme formado no disco de plástico foi lavada durante 30 min com 10 mM de tampão de citrato (pH 3,5; Cit), 0,5 M de cada um de L-arginina (Arg), L-glicina (Gli), L-lisina (Lys) ou L-alanina (Ala), que foram ajustados o pH a 3,5 com 10 mM de tampão de citrato. b Quantificação da retenção salivar biofilme sobre os discos. O violeta cristal foi eluída a partir dos discos mostrados no painel A com ácido acético e a sua absorvância a 550 nm foi medida. valores relativos à amostra de citrato são mostrados
efeito desestabilizador de ácido L-arginina sobre biofilmes orais
Para melhor avaliar o efeito desestabilização do ácido L-arginina (pH 3,5) no biofilme oral humana, as amostras de saliva foram coletadas de quatro voluntários saudáveis (# 4, # 5, # 6 e # 7). análise de sequenciação 16S rDNA baseado em Illumina mostraram que estas amostras continham o microbioma consistente com vários relatórios anteriores sobre saliva humana [35, 36]: Streptococcus
(, 23,2-44,5% de taxa de abundância mais predominante neste estudo), Prevotella
, Neisseria
, Veillonella
, Rothia
, Fusobacterium
, Gemella
, Porphyromonas
, Haemophilus
, Granulicatella,
e Actinomyces
eram comumente detectada como os géneros abundante (ver arquivos adicionais 1, 2 e 3 para um resumo detalhado das taxas de abundância).
As amostras de saliva foram adicionados a micropoços contendo BHI e 1% de sacarose (20% v /v) e biofilmes foram formados após incubação em anaerobiose durante 72 h. Curiosamente, as características de biofilme diferiram entre amostras, em que os biofilmes salivares de dois indivíduos (# 5 e # 6) firmemente ligados aos poços (definida como biofilmes a cheio), enquanto os outros dois (# 4 e # 7) foram facilmente retirado pela lavagem com solução salina (definida como biofilmes frágeis) (Fig. 3a). Lavar os poços com ácido L-arginina a partir de biofilmes mais destacadas # 5 e # 6 do que soro fisiológico (p
& lt; 0,05), ao passo que o citrato 10 mM (pH 3,5) sozinha era semelhante ao de uma solução salina. FIG. 3 A desestabilização de biofilmes orais por ácido L-arginina. A limpeza efeito de solução salina, citrato 10 mM (pH 3,5) ou L-arginina em citrato 10 mM (pH 3,5) em biofilmes estabelecidos utilizando saliva humana sozinha (a) ou saliva humana misturada com S. mutans
GS5 (1 foi examinada% v /v) (b). Os biofilmes derivado de saliva humana foram preparadas de micropoços. Depois de lavar com os reagentes de teste, os biofilmes sofridos foram coradas com violeta de cristal. Os números indicam os IDs dos voluntários. Solução salina, citrato 10 mM (pH 3,5) e ácido L-arginina (pH 3,5) são indicados por colunas a azul, vermelho, verde e, respectivamente. Os dados são expressos como média ± desvio padrão, e a análise estatística foi realizada por ANOVA seguido pelo teste de Tukey. O p
-Valores menos do que 0,05 foram considerados significativos
Para simular o biofilme cariogénicos, S. mutans
GS5 foi adicionado a 1% do volume final bem. A adição de S. mutans
GS5 mudou a estrutura do biofilme e aumentou o apego aos micropoços, especialmente em amostras de saliva que se formaram biofilmes frágeis (Fig. 3 e adicionais de arquivo 4). Semelhante ao ensaio de limpeza, sem biofilme S. mutans
GS5, ácido L-arginina significativamente mais biofilme individual derivada da saliva de # 5 e # 6 (Fig. 3a). Em contraste, a estirpe contendo biofilme GS5 tornou-se sensíveis à lavagem com citrato 10 mM (pH 3,5) (Fig. 3b). Enquanto isso, ácido L-arginina (pH 3,5) e citrato 10 mM (pH 3,5) também tendeu a reduzir biofilmes formados por amostras de saliva de formação de biofilme frágeis (# 4 e # 6) e S. mutans
GS5, mas não foram observadas diferenças significativas.
estrutura de biofilme após a lavagem com ácido L-arginina
para comparar ainda mais a saliva humana (# 4 a # 7) biofilme -derived após a lavagem com solução salina, citrato (pH 3,5), ou ácido L-arginina (pH 3,5), microscopia eletrônica de varredura (MEV) foi realizada. O biofilme foi preparado de um disco de plástico usando cada uma das amostras de saliva e lavou-se com as três soluções de ensaio (solução salina, pH 3,5 10 mM citrato, pH 3,5 ou 0,5 M de L-arginina). A área de biofilme de retenção após a lavagem foi quantificada em cinco campos SEM selecionados aleatoriamente por software Photoshop CS6. Como mostrado na Fig. 4, a massa de biofilme foi reduzido para o mais alto grau por ácido L-arginina (pH 3,5). Para as amostras foram lavadas com solução salina e citrato 10 mM (pH 3,5), objectos grossos, esteira semelhante foram retidos após a lavagem, ao passo que a L-arginina ácido removida a maior parte destas estruturas (arquivo adicional 5). FIG. 4 Quantificação de biofilme bucal sustentada após a limpeza. biofilmes orais foram formados em discos de plástico por cultivo anaeróbico em caldo BHI contendo sacarose (1%) e saliva humana (10%). Depois de 72 h de cultura a 37 ° C, os discos foram lavados com 1 ml de PBS (pH 7,4). Os discos foram depois lavadas com 1 ml de solução salina, citrato 10 mM (pH 3,5) ou 0,5 M de L-arginina (pH 3,5) durante 30 min antes da fixação com glutaraldeído a 2% em tampão cacodilato 0,2 M para microscopia electrónica de varrimento. áreas de biofilme foram medidos usando uma ferramenta de selecção automática baseada em cor no Photoshop CS6, e as razões relativas ao campo de observação, foram calculados. foram examinados pelo menos cinco campos selecionados aleatoriamente. Os dados são expressos como média ± desvio padrão, e a análise estatística foi realizada por ANOVA seguido pelo teste de Tukey. O p
-Valores menos do que 0,05 foram considerados como sendo grupos bacterianos orais
significativas susceptíveis a lavagem com ácido L-arginina
análise de sequenciação de 16S ADNr baseado no Ilumina foi realizado para identificar os grupos de bactérias que eram sensíveis aos lavagem com ácido L-arginina. Testamos biofilme salivar de amostras # 4 e # 5 para representar biofilmes sólidos e frágeis, respectivamente. biofilmes salivares foram preparadas no disco de plástico e lavou-se com solução salina, citrato 10 mM (pH 3,5) ou 0,5 M de L-arginina (pH 3,5) durante 30 min. Os biofilmes destacadas nas soluções de teste foram coletadas por centrifugação (fração lavou-out). Os biofilmes de retenção sobre os discos foram destacadas por sonicação e recolhido por centrifugação (fracção de retenção). Os ADN foram purificados a partir de ambas as facções. Como mostrado na Fig. 5, Streptococcus Comprar e Lactobacillus
compartilhada 86,8-98,3% das populações de biofilme em ambas mantido e frações desbotadas. biofilme sólido (# 5) continham mais do que Lactobacillus
biofilme frágil (# 4). Curiosamente, o Streptococcus
proporção na fracção lavou-se com tampão de citrato (10 mM, pH 3,5) foi mais elevada do que naqueles com solução salina ou 0,5 M de L-arginina (pH 3,5). Por outro lado, Lactobacillus
tendia a manter nos discos, após lavagem com citrato (pH 3,5). Estes resultados indicaram que o citrato (pH 3,5) de preferência lavado para fora Streptococcus
de ambos os tipos de biofilme. Por outro lado, o perfil microbiana das fracções de lavagem tratados com ácido L-arginina foi semelhante ao observado para o soro fisiológico, indicando que ácido L-arginina (pH 3,5) de forma não específica independente bactérias a partir de biofilmes formados em discos de plástico. FIG. 5 Análise microbiota comparativo de frações contínuas e desbotadas com ácido L-arginina. Frágeis (de # 4) e biofilmes sólidos (# 5) foram formados em discos de plástico, que foram então lavadas com solução salina (S), 10 mM de citrato de pH 3,5 tampão (CA), ou L-arginina ácido (LA). A composição microbiana da fracção restante sobre os discos e a fracção lavou-out foram comparadas por análise de sequenciação de 16S ADNr baseado Ilumina-
Discussão A arginina desiminase
em bactérias orais metaboliza a L-arginina, que por sua vez, eleva o pH da ambiente oral, que podem suprimir a formação de cárie dentária. Assim, a L-arginina tem sido explorada como um suplemento potencial para cuidados de higiene oral [37]. Além disso, concentrações elevadas de L-arginina (5,0-10,0%) foram referidos como inibindo a formação de biofilmes de S. mutans cariogénicas
[26]. Neste estudo, exploramos a efeito de limpeza de L-arginina em biofilmes orais para demonstrar os benefícios deste aminoácido básico para cuidados de higiene oral. inibição de L-arginina de S. mutans
formação de biofilme era de facto dependente do pH (Fig. 1), porque entre o intervalo de valores de pH testados (3,5-7,0), reduções significativas na formação do biofilme foram observadas apenas em pH 3,5 . Portanto, testou-se concentrações relativamente elevadas (0,5 M) de ácido L-arginina (pH 3,5) no presente estudo, e mostrou a eficácia desta solução na remoção de biofilmes orais já estabelecidas. Uma vez que a L-arginina aumenta a solubilidade da proteína por afectar as interacções proteína-proteína e este efeito é evidente em condições ácidas [38, 39], o efeito de limpeza em biofilmes orais por ácido L-arginina que foi observada aqui é provavelmente derivada a partir de uma desestabilização de bacteriana agregação.
Durante o curso deste estudo, Kolderman et ai. relataram o efeito desestabilizador de L-arginina em biofilmes formados pela saliva reunidos a partir de seis voluntários saudáveis [40]. Este estudo relatou que a pH neutro L-arginina (0,1-0,5 M) de forma eficaz desestabilizado biofilme oral. Aqui, mostramos que o pH ácido L-arginina não só desestabilizado biofilme oral humana, mas também inibiu a formação de biofilme por S. mutans
, embora seja difícil comparar os resultados em ambos os estudos, devido a diferenças no sistema de ensaio utilizado biofilme: o Kolderman et ai. estudar saliva isento de células utilizado filtrada, tal como um nutriente, enquanto que aqui utilizou-se BHI contendo 1% de sacarose como o meio de suporte para a formação do biofilme. A sacarose é um açúcar cariogênico que aumenta o volume e solidez do biofilme oral. O efeito de sacarose na produção in vitro a formação de biofilme oral foi claramente observado no presente estudo, em que adicionada sacarose aparentemente alterou a massa de biofilmes e a sua composição com um aumento marcado no número de bactérias em forma de bastonete (arquivo adicional 4). Considerando que o Streptococcus e Lactobacillus
eram os componentes predominantes dos biofilmes orais testadas neste estudo (Fig. 5), estas bactérias em forma de bastonete foram provavelmente lactobaclli. Tais sólidos-biofilmes formados em meios ricos podem ser difíceis de remover por neutro L-arginina, e as condições ácidas podem facilitar a desestabilização dos agregados por L-arginina. Na verdade, Ikeda et ai. revelou que o efeito antiviral de 0,7 M de L-arginina do tipo de vírus influenza A foi mais evidente quando o pH estava abaixo de pH 5,0 [41]. Foram selecionados
tampão citrato para ajustar o pH da solução de L-arginina, pois este ácido tem actividade quelante. O efeito inibitório de agentes quelantes em biofilmes microbianos é bem conhecida, tal como evidenciado pela utilização frequente de EDTA ou citrato em soluções de controlo de cateter. A co-agregação de S. mutans e Lactobacillus
tem sido relatada como sendo dependente de cálcio [42], enquanto que as ligações apertadas no interior de S. mutans
em bactérias Streptococcus
biofilmes mediadas por lectinas de ligação são glucano
