da arte abstracta
Fundo
Nano-hidroxiapatita (NHA) é um potencial biomaterial ideal para regeneração óssea. No entanto, estudos têm ainda de caracterizar o comportamento de osteoblastos humanos derivados de osso alveolar em nHA. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar a influência de nHA na adesão, proliferação e diferenciação dessas células derivadas de osso alveolar.
Métodos
osteoblastos alveolares humanos primários foram coletados a partir do rebordo alveolar de um macho paciente periodontal durante a cirurgia ressectivo óssea e cultivadas em placas de cultura revestidas com qualquer polilisina ou polilisina com (POL /ANS) compósito nano-hidroxiapatita. As células foram cultivadas e observadas por 14 dias, e depois avaliadas para possíveis modificações para osteoblastos homeostase avaliada pela reacção quantitativa reversa da cadeia de transcriptase-polimerase (real time RT-PCR), microscopia eletrônica de varredura e microscopia de força atômica.
Resultados
PCR em tempo real revelou um aumento significativo na expressão de marcadores seleccionados de diferenciação dos osteoblastos (proteína morfogenética óssea (BMP) -2, -5, -7, ALP, Coll-1A2, CO, nO) em células cultivadas na POL substrato /nHA. Além disso, em comparação com a superfície do pol, as células crescidas sobre a POL /substrato nHA demonstraram melhores propriedades osteocondutoras, conforme demonstrado pelo aumento da adesão e propagação, provavelmente como resultado do aumento da rugosidade da superfície do compósito.
Conclusões
o aumento da expressão de BMPs e biomarcadores osteoindutoras sugerem que nano-hidroxiapatita pode estimular a proliferação e diferenciação de osteoblastos alveolares locais e, assim, incentivar a regeneração óssea em locais de regeneração óssea alveolar.
osteoblastos Palavras-chave
Nanohydroxyapatite Humanos osso alveolar material suplementar regeneração Electrónicas | a versão online deste artigo (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-22) contém material suplementar, que está disponível para usuários autorizados
Fundo
a principal. preocupação de periodontia é a reabilitação dos dentes devido à doença periodontal, possivelmente, visando a regeneração dos tecidos periodontais completo [1]. Idealmente, este processo iria incluir a formação de osso novo, novo ligamento periodontal e cemento novo, ou melhor, uma nova fixação na raiz que tenha sido previamente privados de todo o aparelho de ligação [2]. As abordagens terapêuticas na tentativa de alcançar este objectivo incluem o uso de diferentes materiais de enxerto (autógeno, alogênico, xenogénica e material autógeno), barreiras físicas para Tecidual Guiada Regeneração (GTR), proteínas derivadas da matriz do esmalte, e vários fatores de crescimento [3, 4 ].
Supõe-se que o uso de enxertos de osso ou de materiais aloplásticos resultaria em ambos o crescimento de osso alveolar e a formação de uma nova camada de cemento com fibras de colagénio inseridos sobre a superfície da raiz anteriormente periodontites-envolvidos [5]. O mecanismo de acção pode ser, quer através da estimulação de osteogénese (formação de osso novo a partir de células formadoras de osso contido no enxerto), osteocondução (quando o enxerto serve como uma estrutura de suporte para a formação óssea do osso hospedeiro adjacentes), ou osteoindução ( a matriz do enxerto ósseo contém substâncias de indução do osso que resultam na formação dos ossos nos tecidos circundantes, ainda que não tecido ósseo) [6]. Materiais aloplásticos se presume para promover a cicatrização óssea através osteocondução e, subsequentemente, comportam-se como um andaime para este processo [5].
Um andaime ideal é um material biocompatível, que proporciona um suporte mecânico apropriado [7]. Ele deve possuir uma estrutura semelhante à matriz extracelular nativa, exibem propriedades favoráveis de superfície, e levar a um aumento da adesão, proliferação e diferenciação de células osteoblásticas [7]. A hidroxiapatite (HA) [Ca
5 (PO 4) 3 OH] é um material aloplástica, quimicamente semelhante ao componente inorgânico da matriz óssea que traduz estas propriedades num biocompatibilidade valioso e óptima [7] . Quando HA é enxertado por baixo de uma periósteo saudável e osso muito vascularizada, ele primeiro se torna integrada por um coágulo [8] e, em seguida, libera íons de fosfato para o ambiente circundante, o que estimula a neo-osteogênese.
Um fator fundamental que rege a melhor integração possível de HA com osso é as dimensões dos cristais. partículas de HA com dimensões mais estreitas para o tamanho de cristais naturais encontrados em tecidos duros vertebrados (isto é, variando de 1 a 10 nm), estão agora disponíveis [9], e que têm sido relatados para imitar a matriz extracelular dos ossos em tamanho e estrutura [10]. Em estudos in vitro realizados
com a finalidade de compreensão do mecanismo de acção deste material de tamanho de nano-têm descrito um efeito estimulador sobre as células estaminais mesenquimais [11], um aumento na absorção de proteína e adesão de osteoblastos, em comparação com micro porte tradicional HA [12, 13], a estimulação da proliferação de células semelhantes a osteoblastos humanos, resultando em formação óssea [14], e a estimulação da ligação de células PDL [15]. Apesar disso, há pouca informação até à data sobre as respostas dos osteoblastos alveolares humanos em contato com esse material de enxertia uma vez que o defeito ósseo foi preenchido. Assim, o objetivo do nosso estudo foi avaliar in vitro
os efeitos da nHA sobre a adesão e proliferação de osteoblastos alveolares humanos e determinar o impacto que este material aloplástico tem sobre a expressão de biomarcadores de formação óssea durante HA-mediada regeneração óssea periodontal.
Métodos
Isolamento de humanos osteoblastos primários
osso humano fresco retirado da crista alveolar foram obtidos com a aprovação do Comitê de Ética da Universidade Sapienza de Roma e consentimento informado do paciente.
primária humana osteoblastos alveolares (Placas) foram colhidas a partir de um paciente periodontal macho de 53 anos de idade, durante a cirurgia periodontal ressectivo de acordo com um protocolo previamente validado [16, 17].
espécimes osso colhido foram armazenados em Solução Salina equilibrada de Hank (HBSS, Sigma -Aldrich, St. Louis, MO) contendo 100 U /ml de penicilina e 100 mg /ml de estreptomicina até ao processamento. Para o processamento, as amostras de osso foram lavadas em solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4, fragmentado, com um bisturi, e digeridas em solução de 1 mg /ml de colagenase de tipo IV e 0,25% de tripsina (em PBS) a 37 ° C durante 30 min com agitação, seguido duas fases de digestão adicionais durante 40 min e 90 min, como descrito anteriormente [18, 19]. As células obtidas a partir do segundo e terceiro digestões foram recolhidas, centrifugadas e ressuspensas em Dulbecco Modified Eagles Médium (DMEM, Gibco-BRL, Rockville, MD) suplementado com 50 U /ml de penicilina, 50 ug /ml de estreptomicina, 4 mmol /l de L- glutamina e 10% de soro fetal de bovino (FBS, Hyclone, Thermo Scientific, Wilmington, dE). Células adesão, proliferação e morfologia foram inspeccionados visualmente por microscopia (Nikon Eclipse TS100, Nikon, Tokyo, Japão) durante o período de tempo de 2 semanas. Após as células atingiram 70-80% de confluência, elas foram desprendidas com tripsina-EDTA, colhidas e utilizadas para experiências de entre as passagens 2 e 4.
poli-L-lisina e poli-L-lisina-nHA preparação revestimento
um mililitro por 25 cm 2 de 0,01% de poli-L-lisina solução (POL, Bioreagent, peso mol 150,000-300,000, esterilizado por filtração, Sigma-Aldrich) foi usado para revestir as superfícies das placas de Petri. As amostras foram agitadas suavemente a 4 ° C a 1200 rpm durante 10 minutos para homogeneizar a estratificação. As superfícies foram então lavadas com água estéril e deixada a secar à temperatura ambiente. Subsequentemente, 10 mg de pó nHA (Ghimas Spa, Casalecchio di Reno, BO, Itália) foi ressuspenso em 1 ml de água estéril e utilizado para revestir as placas tratadas-POL. Finalmente, as superfícies revestidas foram lavadas com água estéril e deixadas a secar
osteoblastos e osteoblastos-POL-POL-nHA amostras preparação
comportamento de osteoblastos foi examinada em placas revestidas utilizando dois testes:. No Teste 1, as placas revestidas apenas com POL foram semeadas com placa para a uma densidade de 2 × 10 4 células /cm 2; no Teste 2, placa foram semeadas à mesma densidade em placas revestidas com pol e nHA pó. Amostras de Teste 1 e Teste 2 foram cultivadas sob as mesmas condições experimentais (95% de humidade, 5% de CO 2, 37 ° C) em DMEM contendo 10% de FBS. As experiências foram realizadas em triplicado e repetidas três vezes por microscopia de electrões.
Digitalização
propriedades de superfície das placas revestidas e a morfologia dos osteoblastos foram visualmente investigada por microscopia de varrimento de electrões (SEM). Após 24 h de cultura em POL ou superfícies POL-nHA revestidos, as amostras foram lavadas duas vezes com PBS, fixadas em glutaraldeído a 2,5% durante 1 h, lavou-se com água destilada, desidratadas em concentrações crescentes de álcool (50%, 70%, 90% , etanol a 100%) e, finalmente, tratou-se com CO 2 no ponto crítico superior. Os espécimes foram fixados em tocos de alumínio usando uma fita condutora de carbono e, em seguida, revestidos com uma camada de ouro de 10 nm (Unidade de revestimento E5000, Polaron Ltd. Watford, Reino Unido). Os espécimes foram observados com SEM (Leo 1450VP, Carl Zeiss, Jena, Alemanha), a diversas ampliações, utilizando elétrons secundários em 15 kV.
Microscopia de força atómica
microscopia de força atômica (AFM) foi realizada utilizando um Nanonics imagem AFM sistema (Jerusalém, Israel) em um modo sem contato e uma tensão de referência de 0,8-1,0 V entre a ponta ea superfície da amostra durante todos os experimentos. a expressão gênica
Após 14 dias de cultura no POL e POL-nHA superfícies, o ARN foi extraído de acordo com o protocolo previamente descrito [18]. RNA foi revertida transcrito utilizando o kit de transcrição reversa TaqMan (Applied Biosystems, Life Technologies, Foster City, CA), utilizando hexâmeros aleatórios. PCR em tempo real foi então realizada utilizando um ensaio de SYBR a expressão do gene verde (Applied Biosystems) em um sistema de PCR em tempo real ABI Prism 7300 (Applied Biosystems) para avaliar as alterações na expressão de marcadores osteogénicas: fosfatase alcalina (ALP), A2 pró-colagénio tipo de cadeia 1 (Coll-1A2), proteína morfogenética óssea (BMP) -2, BMP-5, BMP-7, osteocalcina e osteonectina. O gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) foi usado como um controle endógeno. As sequências foram desenhados usando software Primer Express (Applied Biosystems) e sintetizados por Primm (Milão, Itália). Primers estão listadas na Tabela 1. A expressão gênica foi analisada de acordo com o método ΔΔCT, com os níveis de ensaio 2 de expressão (POL /ANS) amostras normalizado no sentido de Teste 1 (POL) values.Table 1 primers humana usados na RT- PCR para a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), fosfatase alcalina (ALP), A2 pró-colagénio de tipo 1 da cadeia (Coll-1A2), proteína morfogenética do osso-2, -5, -7 (BMP-2, -5, -7)
alvo gene
Primer sequences
GADPH
5′-GGAGTCAACGGATTTGGTCGTA-3′
5′-GGCAACAATATCCACTTTACCAGAGT-3′
ALP
5′-TGCGGAAGAACCCCAAAG-3′
5′-ATGGTGCCCGTGGTCAAT-3′
Coll-1A2
5′-CCCAGCCAAGAACTGGTATAGG-3′
5′-GGCTGCCAGCATTGATAGTTTC-3′
Osteocalcin
5′-AGCAAAGGTGCAGCCTTTGT-3′
5′-GCGCCTGGGTCTCTTCACT-3′
Osteonectin
5′-CCACACGTTTCTTTGAGACC-3′
5′-GATGTCCTGCTCCTTGATGC-3′
BMP-2
FW5′-CCAGCTGTAAGAGACACCCTTTG-3′
RV5′-ACCCACAATCCAGTCATTCCA-3′
BMP-5
FW5′-CGTCCTCTGCACCTCTCTTTATG-3′
RV5′-CTCCGACTCTTCAGGATTTTCTTC-3′
BMP-7
FW5′-TCTTCCACCCACGTACCA-3′
RV5'-GCTTCCCCTTCTGGGATCTT-3 '
análise estatística dos dados in the Statistical Package for Social Sciences (SPPS v15.0, SPSS Inc. Chicago, IL) foi utilizado para a análise estatística . As análises foram realizadas utilizando t de Student
-teste. Significância foi estabelecido em p & lt; 0,05.
Resultados
osteoblastos humanos extração e cultura primária
osteoblastos conectados com sucesso para as superfícies de substrato e foram observados se submeter a proliferação a partir do dia 4 ao dia 14, como determinar por inspeção visual por microscopia (Figura 1A-C ). Figura 1 osteoblastos primários Humanos. (A) Depois de 4 (B) Após 5 dias (C) após 14 dias (ampliação original, 20 ×).
POL e POL-Nha propriedades rugosidade
A rugosidade das duas superfícies de substrato foi avaliada por MEV e AFM. A rugosidade da superfície nanométrica avaliada por AFM foi de 49,7 rms /nm para POL-nHA e 6.3 rms /nm para POL. Assim, as placas cobertas de POL-nHA mostrou um 7,89-vezes mais elevada rugosidade superficial nanométrica em comparação com as placas de Pol (Figura 2A-D). Além disso, observações SEM revelaram a morfologia das partículas NHA para ter uma forma semelhante a haste de 70-90 nm de diâmetro. Microscopia de Varredura Figura 2. (A) Microscopia electrónica imagem dos substratos de polilisina (POL). (B) microscopia de força atômica de POL /nanohydroxyapatite. (C) Microscopia Eletrônica de Varredura. (D) microscopia de força atômica de POL /nanohydroxyapatite (POL /ANS).
Efeito da nano-hidroxiapatita na adesão de osteoblastos e proliferação
Os potenciais modificações morfológicas hOBs foram avaliados após as células foram semeadas em placas revestidas com POL e POL-nHA. Após 24 h, as células que crescem em placas revestidas com POL manteve uma forma esférica (Figura 3A), enquanto que as células no substrato POL-nHA parecia estar ligado firmemente, como demonstrado pela presença de numerosas extensões filopodia (Figura 3B), sugerindo que as partículas Nha melhorou a adesão dos osteoblastos e espalhando. Além disso, as imagens obtidas por AFM mostraram que hOBs cultivadas em POL /nHA adere mais fortes do que aqueles em POL sozinho, como se mostra pelo aumento da rugosidade superficial nanométrica (Figura 3C-D). Figura microscopia eletrônica de varredura 3 (SEM) e microscopia de força atômica (AFM). (A) células crescidas em POL apareceu esférica com fibras retraída. (B) Células cultivadas em POL /nHA apareceram alongadas e com muitos filopios. (C) Células cultivadas em POL apareceu esférica com fibras retraída. (D) Células cultivadas em POL /nHA apareceram alongadas e com muitos filopios.
Efeitos de nano-hidroxiapatita na expressão do gene de osteoblastos humanos
O ARN foi extraído de células cultivadas durante 14 dias em ambos os substratos (Pol contra POL /nHA) e submeteu-se em tempo real de RT-PCR para avaliar as alterações na expressão de genes específicos de diferenciação osteoblásticas (Tabela 1): BMP-2, -5 e -7, ALP, Coll-1A2, CO e nO, bem conhecidos marcadores de diferenciação. Como mostrado na Figura 4, BMP-2, BMP-5 e BMP-7 foram aumentadas em aproximadamente 1,7, 4,5 e 4,3 vezes, respectivamente, em hOBs cultivadas em substratos POL /NHA, em comparação com aqueles cultivados em POL sozinho (p & lt; 0,05). Curiosamente, Coll-1A2, OC e na expressão foi de 1,6, 1,9 e 2,1 vezes superiores, respectivamente, em hOBs cultivadas em POL /nHA em comparação com aquelas cultivadas em Pol (p & lt; 0,01). ALP foi também aumentado em 2,5 vezes hOBs cultivadas em POL /nHA (p & lt; 0,01), sugerindo um aumento da diferenciação destas células sob condições de cultura actuais. Figura 4 A expressão gênica de placas colocadas em cultura na POL e POL /nHA.
geral, os nossos resultados mostram que, dentro de um prazo de 14 dias, o substrato POL /nHA pode melhorar a expressão de genes específicos osteoblásticas, o que indica fortemente um efeito positivo da diferenciação dos osteoblastos em nHA (Figura 4).
discussão
hidroxiapatita, entre os vários substitutos de enxerto ósseo, tem sido amplamente investigada na regeneração periodontal ao longo das últimas três décadas [4, 20]. HA material autógeno, apesar da sua composição química semelhante à do osso, são conhecidos, principalmente, pelas suas propriedades osteocondutoras [5]. Nosso estudo confirmou as propriedades de osteocondução de uma versão de tamanho nano-deste material, mostrando que nHA pode estimular os osteoblastos a produzir biomarcadores representante selecionado da formação óssea e recrutamento de células mesenquimais.
A justificativa para a escolha dos osteoblastos alveolar humano é baseado no facto de que estas células estão localizados sobre a superfície do osso do defeito, o que significa que o material enxertado vai estar em contacto directo com estes osteoblastos durante a cicatrização. O método de colheita de células foi realizada utilizando um bisturi osso como parte de uma técnica bem documentado utilizado durante a cirurgia periodontal ressectivo [21, 22]. Cultura de células e formação dos substratos foram realizadas seguido modelos anteriormente utilizados (dispersão de partículas de nHA em Poli-etileno-glicol-dimetacrilato ou nHA associados com um policarbonato, poliamida, polissacárido) [23-27]. alveolares osteoblastos humanos são as células primárias responsáveis pela formação de osso alveolar, embora eles não parecem ser capazes de migrar e proliferar em locais distantes em que é necessária a regeneração óssea. Albrektsson & amp; Johansson sugeriu que as células pré-osteoblásticas existentes contribuem apenas uma pequena parte do osso novo, necessário numa situação de cicatrização de fractura e que o recrutamento de células imaturas e a sua diferenciação em osteoblastos são, provavelmente, a cicatrização óssea mecanismo básico e crucial regulando [6]. Com efeito, os osteoblastos têm sido mostrados para contribuir para a produção de factores de crescimento que estimulam a migração celular, bem como a diferenciação osteogénica e condrogénica de células progenitoras mesenquimais [28]. O nosso estudo demonstra que nHA estimula os osteoblastos alveolares locais para produzir relevante BMPs específica do osso, que são conhecidos para iniciar e regular a formação de osso a partir das células progenitoras.
Vários tipos de BMPs, que pertencem ao factor de crescimento transformante (TGF ) -β família, têm sido investigados e caracterizado pelo seu papel modulador na homeostase do tecido ósseo. BMP-2 e BMP-7 são de particular interesse, uma vez que eles são naturalmente libertados em resposta a um trauma ou durante a remodelação óssea e são, até à data, os únicos agentes indutores conhecidos [6]. Estimulação de BMP-2, -5 e -7 é um aspecto importante da osteogénese, uma vez que estas proteínas são os três factores de crescimento dos mais potentes aumentando a formação de osso. Os resultados aqui apresentados mostram que nHA promove a expressão BMP por osteoblastos alveolares in vitro
. Esta observação sugere que nHA pode actuar como promotor da regeneração do osso no sítio do defeito do osso de duas maneiras: por indução da diferenciação osteogénica como observado por bloqueio et ai. [11] e /ou através da indução da secreção de factores específicos, tais como BMP ou outros factores de crescimento não testadas nesta experiência. Além disso, a ASN influenciado um aumento significativo na expressão de vários marcadores importantes de ALP osteogénese, CO, NO e Coll-1A2.
Para instigar a formação óssea, as células necessitam de aderir e proliferar. A rugosidade da superfície é uma consideração importante na escolha de um substrato de indução do osso. De acordo com os princípios físicos e mecânicos, um substrato com a rugosidade superficial mostra uma maior capacidade de adesão quando em comparação com uma superfície lisa [29-32]. Neste estudo, a adesão de osteoblastos foi avaliada com base em mudanças na forma celular e sobre a presença de filopódios. As imagens SEM e AFM mostraram que nHA tinha uma superfície mais áspera do que o substrato de controlo e favoreceu a adesão e proliferação de osteoblastos humanos. Estes resultados estão de acordo com os relatados por Thian et ai., Que mostra que nHA melhorada a adesão e disseminação de células semelhantes a osteoblastos humanos [33] e Liu et ai., Demonstrando a indução de adesão e proliferação de MG- semelhantes a osteoblastos humanos 63 células em nHA [14].
Conclusões
Dentro dos limites deste estudo, observou-se que nHA pode aumentar significativamente no local humana adesão de osteoblastos alveolar e diferenciação, e, portanto, especular que nHA poderia estimular a formação óssea por osteoblastos locais em locais de reconstrução óssea alveolar. Além disso, o aumento da expressão de BMPs na superfície a ASN pode indicar um aumento no recrutamento de células progenitoras durante a cicatrização com andaimes NHA. Estes in vitro
descobertas podem explicar, pelo menos em parte, a nova formação óssea testemunhou em defeitos ósseos preenchidos com material nHA enxerto [34, 35] e sugerir a continuação do papel do nHA em processos de reaplicar a periodontais, incluindo a formação de novo cemento e do novo ligamento periodontal. Outros estudos histológicos e clínicos são necessários para dar um significado às in vitro
resultados, bem como uma explicação biológica dos resultados clínicos observados por outros.
Declarações
Autores 'original apresentada arquivos para imagens
Abaixo estão os links para os arquivos enviados originais dos autores para imagens. 'arquivo original para a figura 1 12903_2013_367_MOESM2_ESM.tiff Autores' 12903_2013_367_MOESM1_ESM.tiff Autores arquivo original para a figura 2 12903_2013_367_MOESM3_ESM.tiff 'arquivo original para a figura 3 12903_2013_367_MOESM4_ESM.tiff Autores dos autores arquivo original para o arquivo original figura 4 12903_2013_367_MOESM5_ESM.png dos autores para a figura 5 interesses concorrentes
os autores declaram que não têm interesses conflitantes. contribuições
dos autores
AP e SM foram os principais investigadores do estudo. Eles fizeram contribuições substanciais para a concepção e design, bem como a aquisição, análise e interpretação dos dados; GP, MS, GDC e BZ estiveram envolvidos na elaboração do manuscrito ou revisão crítica de importante conteúdo intelectual, e deu aprovação final da versão a ser publicada. LR, MB e FW fez contribuições substanciais na aquisição de dados e participou da elaboração do manuscrito e ajudou na revisão do manuscrito. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.
