juncional gengivais humanos da arte abstracta
Fundo
Este estudo tem como objetivo observar as características morfológicas e identificar as características funcionais do epitélio juncional tecidos (JE) e células cultivadas JE.
Métodos
as secções de parafina de molar humano ou pré-molar no lado vestíbulo-lingual gengival foram preparados a partir de 6 indivíduos. Coloração HE e análise de imagem foram realizados para medir e comparar a diferença morfológica entre JE, epitélio oral gengival (OGE) e do epitélio sulcular (SE). A imuno-histoquímica foi aplicado para detectar o padrão de citoqueratina 5/6, 7, 8/18, 10/13, 16, 17, 19, expressão, e 20 em JE, OGE e SE. Por outro lado, as células JE e OGE humanas primárias foram cultivadas in vitro. Celular identificar foi confirmado por histologia e imuno-histoquímica. Em um modelo de co-cultura, TEM foi usado para observar a formação de fixação entre as células JE e superfície do dente.
Resultado
JE humana era um tecido único, que era diferente de SE e OGE na morfologia. Da mesma forma, a morfologia das células JE foi também determinado em comparação com células cultivadas in vitro OGE. Além disso, as células JE tinha um período de incubação mais longo do que as células OGE. expressão diferente de vários CKs ilustrado JE estava em uma característica de baixa diferenciação e alta regeneração. Depois de ser co-cultivadas durante 14 d, múltiplas camadas de células, membrana basal e estruturas semelhantes hemidesmossoma-se como apareceu na junção da membrana celular JE e a superfície do dente.
Conclusões
JE é um epitélio estratificado especialmente com baixo diferenciação e capacidade elevada de regeneração no tecido gengival tanto in vivo como in vitro. No modelo de co-cultura, as células JE humanos podem formar estruturas membrana basal-like e hemidesmossoma semelhantes em cerca de 2 semanas.
Palavras-chave
Juncional epitélio gengival Oral epitélio Cytokeratin Imunohistoquímica Co-cultura material suplementar Electrónicas | O on-line versão deste artigo (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-30) contém material suplementar, que está disponível para usuários autorizados
Fundo
gengival epitélio consiste em três regiões:. epitélio gengival oral ( OGE), epitélio sulcular (SE) e juncional epitélio (JE). JE é um epitélio gengival especializado localizar na junção do tecido mole periodontal e tecido duro, e anexando à coroa ou raiz como um colar. células JE são uniformes na forma (plana ou de fuso) e alinhado paralelamente à superfície do dente, que contém grandes espaços intercelulares devido à junções celulares relaxado [1]. Como uma estrutura especial na junção dento-gengival, JE é diferente de outros epitélios (OGE, SE) na origem, morfologia celular, proliferação e diferenciação [2, 3]. Ao mesmo tempo, tem sido relatado que o JE é crítica para manter a integridade do tecido periodontal [4, 5] e é uma área chave de início primária de doenças periodontais e tratamentos [6]. Além disso, neutrófilos a-defensinas foi encontrado para localizar no epitélio juncional, o que tem efeitos significativos sobre a integridade epitelial e funcionando (a adesão dos queratinócitos, disseminação e proliferação), e os efeitos são para além das suas actividades antibacterianas [7]. No entanto, ainda não está claro e controverso sobre JE na diferenciação, atividade fagocitária, o mecanismo da sua fixação ao superfície do dente, reparação e mecanismo de reconstrução após a lesão [5, 8].
Os métodos histológicos convencionais para investigação de JE in vivo são simplista em aproximação e limitado no intervalo de observação [9-12]. Nos últimos anos, os estudiosos têm estudado o JE usando em modelos de cultura de células in vitro e técnicas citológicas moleculares utilizando animais e /ou células OGE humanos, células epiteliais do ligamento periodontal e as células epiteliais bucais [13-16]. Embora estas células são células epiteliais orais, eles não podem modelar células primárias JE completamente devido a diferenças na fonte, morfologia, estrutura, a diferenciação e os estímulos que induzem a proliferação.
Citoqueratinas (CKs) são proteínas dos filamentos intermediários do citoesqueleto família e são a principal proteínas estruturais em células epiteliais. Como se sabe, a expressão da queratina é uma das características definitivos de células epiteliais e reflecte as propriedades biológicas de células epiteliais, incluindo a sua produção, desenvolvimento, tipo histológico, e o nível de diferenciação [17, 18]. Várias pesquisas têm estudado a expressão e distribuição de uma variedade de CKs (CK-pan, 5/6, 7, 8/18, 10/13, 16, 17, 19, 20) nos tecidos periodontais de seres humanos e animais, ea foram determinados expressão de alguns queratinas no epitélio gengival [15, 19-21]. Por exemplo, os padrões de expressão de CK10 /13, 16, 19 em JE foram diferente do que no OGE e SE; A expressão especialmente elevada de CK19 em todas as camadas de JE feito isso tornou-se um marcador característico histológico para JE in vivo [3, 22-24]. No entanto, as manifestações de diferentes tipos de citoqueratina em JE e a diferença com OGE e SE não foram sistematicamente relatada.
Neste estudo, as características morfológicas dos tecidos JE foram examinados por meio de observação histológica, imuno-histoquímica e análise de imagem. A expressão e a distribuição de uma variedade de CK foram determinados em tecidos de JE e comparados com OGE e SE. Além disso, as células JE e OGE primárias foram cultivadas. O padrão de estrutura e crescimento morfológica de células JE e OGE primários foram observadas e as expressões de queratinas específicas (CK-pan, 19, 10/13, 16) também foram detectados por imuno-histoquímica. Nós suspeitamos para identificar as propriedades biológicas únicas (morfologia, potencial regenerativo) de JE in vivo e in vitro. Além disso, as células humanas de cultura de JE foram semeadas directamente em lâminas de raiz humanos em uma cultura compósita, a fim de explorar o processo de JE nova fixação. Isto forneceria evidência experimental para um estudo mais aprofundado de como novo anexo ocorre após a cirurgia periodontal ea formação de cicatrização do tecido peri-implantar na clínica.
Métodos
características morfológicas dos tecidos epiteliais gengivais humanos
amostras gengivais humanos foram isolados a partir de amostras de mandíbula de quatro do sexo masculino e dois do sexo feminino com ameloblastoma mandibular. Eles eram não-fumantes, sem quaisquer outras doenças. O site idade e de amostragem foi de lista na Tabela 1. A cirurgia ablativa foi realizado no Departamento de Patologia Oral do Hospital Filiado Popular nono para Shanghai Jiao Tong University entre setembro e outubro de 2010. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética local , e o consentimento informado foi obtido de todos os pacientes. molar inferior ou pré-molar e seus tecidos gengivais distantes do local do tumor com morfologia normal foram seleccionados gengival por observação clínica. Além disso, as amostras de menos de 3 mm de profundidade detectado por sondagem periodontal foram recolhidos e fixados em formaldeído a 10% à temperatura ambiente durante 24 h. As amostras foram colocadas em Plank-Rychlo descalcificação solução (70 g de AlCl
3, 56 ml de ácido fórmico, 85 ml de ácido clorídrico e água destilada adicionada a 1 L) durante 2 semanas depois de terem sido cortados vertical para o longo eixo do dente ao longo do lado vestíbulo-lingual usando um serrote. Finalmente, várias secções de espessura de 5 mm de dente e tecido gengival no centro do dente foram obtidos a partir de cada espécimen. Em seguida, estas secções foram submetidas ao etanol desidratação e embebidos em parafina. Três blocos de parafina foram selecionados aleatoriamente a partir de cada amostra e seccionados em 4 mm. Os cortes foram corados com hematoxilina-eosina (HE) e observadas ao microscópio de luz. A largura, espessura, área de JE ea largura da SE no lado bucal foram medidos por Axioplan imagem 2 dimensões de análise system.Table 1 Medido em JE humana e SE
Amostra n.
Idade
local
amostragem
Largura de JE (mm)
Espessura do JE (mm)
Área de JE (mm2)
Largura SE (mm)
1
21
Premolar
1.135
0.069
0.047
0.325
1.134
0.066
0.045
0.321
1.133
0.064
0.043
0.334
2
28
Molar
1.113
0.062
0.043
0.308
1.102
0.066
0.044
0.303
1.120
0.065
0.044
0.323
3
31
Molar
0.850
0.058
0.041
0.563
0.845
0.059
0.041
0.565
0.847
0.060
0.041
0.554
4
28
Molar
0.838
0.052
0.038
0.550
0.844
0.055
0.040
0.552
0.858
0.056
0.040
0.543
5
33
Premolar
1.105
0.083
0.043
0.785
1.108
0.083
0.043
0.801
1.105
0.083
0.041
0.808
6
38
Premolar
1.081
0.069
0.041
0.625
1.072
0.065
0.038
0.667
1.078
0.069
0.040
0.644
Mean
1.021
0.066
0.042
0.532
Standard desvio
0,128
0,009
0,002
0,176
A amostra 2, 3 eram do sexo feminino e a esquerda eram do sexo masculino .
Devido à separação de JE com a superfície do dente após descalcificação, a fronteira entre JE e sE foi determinada de acordo com cristas epiteliais, queratinização, morfologia celular, e a coloração. De acordo com o método de projeção, linhas perpendiculares foram retirados de livre margem de SE, junção do JE e SE, ea parte raiz mais de JE em direção a superfície do dente, respectivamente. Os comprimentos de projecção da SE e JE sobre a superfície do dente foi medido como as suas larguras. Uma linha perpendicular foi desenhada na parte mais grossa de JE e a distância entre os dois pontos de intersecção da linha perpendicular e epitélio foi medida como a espessura de JE. Uma curva foi elaborada a partir da parte mais raiz de JE a sua junção com SE, incluindo toda a região JE e área (Figura 1). Figura descrição da mensuração JE e SE 1 Schematics. largura A. SE; largura B. JE; espessura C. JE; D. JE área.
JE Humana e OGE células cultura
A fim de cultura de células JE e OGE in vitro, incisões de 2 mm de comprimento foram feitas ao longo bucal e gengiva marginal lingual. Cinco dentes saudáveis e totalmente entrou em erupção foram removidos juntamente com os dentes ortodôntico ou impactados (, boa saúde bucal de 12 a 25 anos de idade e gengiva saudáveis clínica). Os dentes em conjunto com a gengiva marginal incisão foram removidos. A gengiva livre (incluindo OGE e SE) foi cortado, tanto quanto possível macroscopicamente. tecidos JE firmemente ligado ao colo do dente (não a raiz) foram raspadas da superfície do dente (Figura 2), e lavadas por solução de D-Hank contendo antibióticos penicilina-estreptomicina duplos. O protocolo do estudo foi aprovado pelo comitê de ética da Zhongshan Hospital (Não: 2009-173). Figura 2 amostras JE. A. irrompeu Retire totalmente dente impactado com gengival marginal; B. cortar o excesso de gengiva livre (incluindo OGE e SE); C. Permanecer tecido JE no pescoço do dente; D. obter o tecido JE raspando no pescoço do dente; E. removido tecidos JE; F. colo do dente liso após raspagem. Online em cultura primária, JE tecidos foram digeridos com 2 ml de solução de trabalho DispaseII a 4 ° C durante 16-18 horas. O epitélio foi separada a partir da lâmina por meio de fórceps, e, em seguida, cortada em pedaços, digerido com 4 ml de 0,025% de tripsina-EDTA a 0,01% durante 5-8 minutos, com agitação. A digestão foi terminada pela adição de solução de D-Hank contendo 10% de FBS, seguido por filtração através de 180 um crivo de aço inoxidável e em seguida centrifugação. Os precipitados foram misturados no (meio de crescimento de queratinócitos definido) DKGM para formar suspensão de células. As células foram semeadas em placas de 24 poços a 2 x 10 5 células /mL, e colocado num banho a 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. O meio foi renovado após 3 dias, pela primeira vez, em seguida, uma vez por dia. Na cultura passagem, as células foram passadas em confluência de 60-70% por adição de 0,25% de tripsina-EDTA a 0,02% a 37 ° C durante 5-8 min. Quando as células apareceram arredondados sob um microscópio, a digestão foi terminada. Em seguida, as células foram suspensas e centrifugado. DKGM foi adicionado para formar a suspensão de células, e dispensados em novas placas de Petri. Por outro lado, as células foram tratadas como OGE células JE acima. Diferentemente, o tecido OGE foi cortado em pequenos pedaços de 5 × 5 milímetros 2. A suspensão de células foi semeada no OGE densidades que variam 5-10 × 10 5 células /ml em placas de petri de 60 mm de diâmetro. As células cultivadas foram observados diariamente usando invertida microscópio de contraste de fase para controlar suas condições morfologia e crescimento. Além disso, a suspensão de célula única passadas foi inoculado com densidades que variam 2-5 × 10 5 células /ml para tampa desliza em placas de petri estéreis. Em seguida, tratada com H & amp; E coloração quando as células foram cultivadas a 60% de confluência, e observados usando um microscópio de luz para acompanhar as mudanças na morfologia e estrutura curva
crescimento celular em células JE e OGE
primária JE, as células do OGE. a 100% de confluência foram digeridos para formar suspensão de células única e semeadas a uma densidade de 2 × 10 placas 4 /cm 2 em 24 poços. As células em dois poços aleatórias foram contadas diariamente usando um hematocytometer. A curva de crescimento de células foi representada graficamente pelo número médio de células por dia versus o número de dias. O tempo de duplicação foi obtida a partir da curva de crescimento que poderia indicar o comprimento de tempo necessário para que as células para o dobro em número, durante a fase logarítmica.
Análise imuno-histoquímica de tecidos gengivais humanos epitélio e Vitro células cultivadas
imuno-histoquímica de estreptavidina conjugada com peroxidase (SP) método foi realizado sobre o tecido gengival humano por incubação com anti-CK 5/6 (clone D5 /16B4), anti-CK 7 (OV-TL12 /30), anti-CK 8/18 (clone Zym5.2) , anti-CK 10/13 (clone DE-K13), anti-CK 16 (clone LL025), anti-CK 17 (clone E3), anti-CK 19 (clone A53 /BA2) e anti-CK 20 (clone KS20 0,8). Estes anticorpos monoclonais anti-citoqueratina humanos foram obtidos a partir de Zymed (U.S. A.). tecido da glândula parótida humana foi corado como controlo positivo [25] e o anticorpo primário substituído por PBS foi utilizado como controlo negativo. O procedimento de coloração imuno-histoquímica foi realizada pelas instruções do fabricante Ab. Simplesmente, desparafinados secções foram incubadas com solução de pepsina a 37 ° C durante 5-10 minutos, e incubou-se com soro de bloqueio à temperatura ambiente durante 30 min. O anticorpo primário a diluição 1:50 foram adicionados no grupo de estudo e o controlo positivo. PBS em vez do anticorpo primário foi adicionado no controlo negativo. Depois de ter sido incubada a 4 ° C durante a noite, as secções foram incubadas na solução de trabalho com anticorpo secundário marcado biotina à temperatura ambiente durante 30 min, e com peroxidase de rábano seguido marcado estreptavidina solução à temperatura ambiente. solução DAB cromogénico foi adicionado durante 5-10 min. As secções foram enxaguadas com água corrente, re-corados com hematoxilina e montadas. Por outro lado, as células aderiram ao subculturas lamelas foram fixadas usando 10% de formalina neutra. As células foram tratadas como acima JE tecidos. Nestas células, CK-Pan, CK19, foram detectados CK10 /13 e CK16. O citoplasma das células positivas CK estava manchado e foi classificado como negativo (-) sem coloração, fracamente positiva (+) com coloração de luz amarela, positiva moderada (++) com coloração de positivo amarelo ou forte (+ + +) com coloração de marrom [26].
Co-cultura de células JE humanos e fatias de raiz
dentes fatias eram das mesmas amostras recrutados para as células primárias JE. As amostras foram imbricadas sucata usando uma cureta Graça para remover a membrana periodontal. Eles foram fixados em formalina a 10% neutra durante 12 h, e descalcificados usando uma solução de descalcificação Plank-Rychlo por 2 semanas. As coroas dentais foram removidas e os dentes foram seccionados ao longo da superfície da raiz em filmes odontológicos de 5 × 5 mm 2 de tamanho e 1-1,5 mm de espessura. As películas foram lavadas durante 2-3D e embebida em solução de D-Hank contendo antibióticos duplos de penicilina-estreptomicina a 4 ° C antes da utilização. A JE suspensão células passadas humano foi inoculado a uma densidade de 5 x 10 5 células /mL sobre as fatias de raiz com o cemento superfície em placas de 24 poços, de 2 a 3 fatias por poço, e colocado, durante 14 d em a 37 ° C, 5% de CO 2 saturação de humidade incubadora. O meio foi refrescado 3 dias mais tarde, e, em seguida, uma vez por dia
Observação utilizando MET:. Fatias de raízes foram recolhidos 3, 5, 7, 9, 11, e 14 d após a inoculação, respectivamente, e fixados em glutaraldeído a 2% a 4 ° C durante 2 h. fatias de raiz, com o cemento superficial acima, foram cortadas em pedaços pequenos de 5 × 1 × 1 mM, pós-fixadas em ácido ósmico a 1% a 4 ° C durante 2 h, desidratados por etanol, embebido por óxido de propileno à temperatura ambiente durante 24 h, e incorporado em araldite. Os espécimes embarcados foram cortados em fatias ultrafinas, que foram coradas utilizando citrato de chumbo, seguido pela observação usando TEM (PHILIP CM-120, Holland) para controlar a formação de JE apego células à superfície do cemento.
Resultados
morfológica análise dos tecidos epiteliais gengivais humanos
Sob o microscópio, JE foi curto e em forma de faixa, gradualmente engrossar a partir da junção cemento-esmalte para a coronal. Depois de coradas com HE, sem queratinização ou cristas epiteliais existia no tecido JE que foi dividido em camada basal e camada suprabasal, enquanto cristas epiteliais queratinizadas ou epitélio parcialmente queratinizado, densas e irregulares projetando-se para o tecido conjuntivo adjacente foram encontrados em SE manchadas de escuro e OGE tecidos (Figura 3A). Além disso, as células de JE foram diferentes de SE e OGE na morfologia e tinha uma fronteira clara com SE (Figura 3B). As células no tecido JE eram uniformes em forma, liso ou eixo, alinhado paralelamente à superfície do dente e as junções celulares foram soltas com espaço intercelular óbvia. No entanto, as células foram OGE SE e todos os polígonos irregulares e firmemente alinhado com menos ou mesmo nenhuma espaço intercelular. Além disso, as células JE eram abundantes em organelas e o núcleo era grande, e de modo semelhante, os núcleos das células e SE OGE também eram grandes mas hipercromático. Além disso, as células SE e OGE apresentou características estruturais típicas de células escamosas e poderia reciprocamente transformar sem limite claro. Figura 3 HE coloração do tecido gengival humano. A. A região entre as setas é JE (x150); B. A fronteira entre JE e SE, a seta aponta para o limite (x1200).
De acordo com medições na análise de imagem, o tecido JE foi 1.021 ± 0,128 mm de largura, 0,066 ± 0,009 mm de espessura, e 0,042 ± 0,002 mm 2 na área, ao mesmo tempo, a sE foi 0,532 ± 0,176 mm de largura (Tabela 1). a análise morfológica do
cultivadas gengivais humanos JE e OGE células in vitro
a fim de observar as células JE claramente e identificar as características, as células JE e OGE foram cultivadas in vitro. Como resultado, semeadas inicialmente células JE primários apresentaram morfologia diversificada, como poligonal plano, fusiforme, oval e esférica. Após 24-96 h de incubação, as células que aderiram ao fundo da placa de petri, o citoplasma ficou escura, a membrana era áspera, e 2-3 células de dobragem foram totalmente esticada. Os núcleos eram grandes e geralmente de 2 a 3 nucléolos em cada célula. Após 7 d, as células gradualmente entrou em período de crescimento rápido e prolongado ao longo da borda placa de petri para o centro. Mitose de células dispersas e clones com morfologia fusiforme ou angular apareceu como se mostra na Figura 4A. Após 10-12 d, clones de células com morfologia variada, de tamanho não uniforme formadas manchas confluentes (Figura 4B). Na primeira passagem, as células aderiram ao fundo da placa e estendida em 24-48 h após a inoculação, em seguida, as células apresentaram morfologia semelhante com as células primárias; Na segunda passagem, as células JE mostrou morfologia irregular como pseudópodos 'células gigantes', e vacuolização citoplasmática (Figura 4C); Nas passagens seguintes, a morfologia foi mais irregular e proliferação celular parecia abrandar, mesmo apresentando sinais de envelhecimento e morte (Figura 4D). Figura 4 Observação da morfologia celular JE e OGE (células primárias). clones de células JE A. formado (a seta × 200); B. No 10-12 d, as células JE apresentaram morfologia não-uniforme e arranjo dispersado (× 200); C. A terceira passagem JE células múltipla 'células gigantes' apareceu (a seta × 200); D. A 5ª passagem células JE mostrou sinais de envelhecimento e morte (× 400); E. os clones de células OGE formado e expandida (a seta × 200); F. No 7-9 d, as células do OGE apresentaram morfologia uniforme, arranjo apertado, e 'pavimentação de pedra-like' queratinizante (× 200); G. Na terceira passagem células OGE 'células gigantes' apareceu (× 200); H. A 7ª passagem células OGE mostrou sinais de envelhecimento e morte (× 400)
Como as células do OGE, inicialmente semeadas células primárias apresentadas formas poligonais ou esféricas e aderiu ao fundo prato dentro de 24-72 h.; Após 5 d, clones de células formadas com morfologia triangular ou poligonal, no entanto, estas células eram mais uniforme do que os clones de células JE do mesmo período (Figura 4E); Depois de 7-9 d, os clones OGE ampliada e convergentes, em seguida, bem organizado e mostrou típico "pavimentação de pedra-like 'queratinização (Figura 4F); Após 9-11 d, as células eram cerca de 100% confluentes; Na segunda passagem, as células aderiram e se estendia em 48 h. E depois das células gigantes 'apareceu (Figura 4G); Depois de ser passadas para 4 vezes, as células foram principalmente 'células gigantes' e proliferação abrandou também com sinais envelhecimento e morte (Figura 4H).
Depois disso, as células JE e do OGE foram coradas com HE e observadas ao microscópio. Como resultado, as células JE apareceu morfologia variada (em forma de fuso, triângulo, oval), de tamanho não uniforme, arranjo relaxado, grandes e escuras núcleos corados e várias divisões nucleares como mencionado acima (Figura 5A). No entanto, as células do OGE foram uniformes em tamanho, bem organizadas, normalmente queratinizado, e com núcleos redonda no centro, bem como divisões nucleares visíveis (Figura 5B). Portanto, JE foram significativamente diferentes dos OGE na morfologia celular. Figura 5 H & amp; E de coloração de células JE e OGE (células segunda subculturas, H & amp; E × 400). células A. JE presente não uniformes em tamanho e morfologia, arranjo disperso, grandes e profundamente manchadas núcleos e múltiplas divisões nucleares; células B. OGE eram uniformes em tamanho e forma, bem arranjado, e 'pavimentação de pedra-like' queratinizante. condição
crescimento de células JE e OGE cultivadas in vitro
Nós, então, analisar as condições de crescimento destas duas células. Havia mais células OGE cultivadas em comparação com JE. Como resultado, o período de incubação as células JE para prender e proliferam foi 1-7 d in vitro, enquanto que para as células era 1-3 OGE d, um pouco mais curto. A fase logarítmica e pico de crescimento de células JE apareceu no 8 th - 12 th d (apenas a duração de 5 dias), enquanto do OGE era de 4 th - 11 th d (8 dias). Depois de 12 d, as células JE e do OGE foram entrou em um período de estagnação. Além disso, o número de células JE cresceu de 6 × 10 4 /ml a 12 × 10 4 /mL durante 9-12 dias, e as células OGE cresceu a partir de 7 × 10 4 /ml a 14 × 10 4 /ml durante 6-10 dias. De acordo com estatísticas, o tempo de duplicação celular de células JE era de 48-60 h, enquanto foi OGE 72-96 h. No geral, OGE exibem mais suavemente curvas do que JE (Figura 6). Como mostrado na Figura 7, as células foram passadas com sucesso JE por 5 vezes, enquanto OGE 7 vezes na presente experiência. A qualidade de células JE passadas diminuíram drasticamente após a terceira passagem, mas depois de 4 th passagem em células do OGE. Figura 6 Curva de crescimento de células JE e OGE. As células foram em JE fase latente (1-7 d após a inoculação), fase exponencial (8-12 d), e fase de plateau (12 d posteriormente). células OGE estavam em fase latente (1-3 d após a inoculação), fase exponencial (4-11 d), e fase de platô (12 d posteriormente).
Figura 7 números passagem de células e número de células por passagem de JE e células OGE. (JE células foram passadas cinco vezes. OGE células foram passadas 7 vezes).
Análise imuno-histoquímica de tecidos gengivais e células epiteliais humanas cultivadas in vitro
A fim de identificar profundamente as características funcionais de JE, foram analisadas várias CKs. Em tecidos epiteliais gengivais humanos, a expressão de CK5 /6 e CK20 foi semelhante, embora CK5 /6 era mais forte manchado. Eles foram positivas coradas na camada suprabasal (especialmente próximo da superfície) e negativo coradas na camada basal; A expressão de CK7 e CK17 foi negativo, ou apenas fracamente positivo em muito poucas células; Em CK10 /13 e CK16, eles foram expressos em todas as camadas de JE, mas apenas na camada suprabasal da OGE e SE; A expressão de CK10 /13 era forte positivo e CK16 foi fracamente positivo ou positivo; CK19 foi detectada em todas as camadas de JE com forte expressão positiva, enquanto que a sua expressão em OGE e SE limitou-se a camada suprabasal e sem coloração foi visto na camada basal. O limite entre JE e SE foi claramente devido à diferença na coloração de CK19; O padrão de CK8 /18 expressão era a um nível inferior, o qual era semelhante à CK19 excepto a camada basal da OGE e SE. Além disso, também apresentaram expressão positiva fraca na camada suprabasal (perto da camada basal) em algumas fatias. As descrições detalhadas foram na Tabela 2 e Figura 8.Table padrão 2 Expressão de diferentes citoqueratinas em JE, OGE e SE
Antibody
CK
Amostra n. (N)
Slice não. (N)
JE
OGE
SE
b
sb
b
sb
b
sb
D5/16B4
5/6
6
20
-
++
-
+
-
+
OV-TL12/30
7
6
10
-
-
-
-
-
-
Zym5.2
8/18
6
15
++
++
+
-*
+
-*
DE-K13
10/13
6
20
+++
+++
-
+++
-
+++
LL025
16
6
18
+
+
-
++
-
+
E3
17
6
11
-
-
-
-
-
-
A53/BA2
19
6
10
+++
+++
+++
-
+++
-
Ks20.8
20
6
14
-
+
-
+
-
+
Nota: b: camada basal, sb: camada suprabasal, -:. Negativa, +: fraco positivo, ++: positiva moderada, +++: forte positivo, *: expressão positiva fraca na camada suprabasal em algumas fatias
Figura 8 mancha imuno-histoquímica dos tecidos gengivais humanos (× 100). Coloração contra diferentes citoqueratinas foi realizada. A. CK5 /6; B. CK7; C. CK8 /18; D. CK10 /13; E. CK16; F. CK17; G. CK19; H. CK20; tecido gengival I humana foi utilizado como controlo negativo; J. tecido da parótida humana foi utilizado como controlo positivo. Online em células cultivadas, ambas as células JE e OGE foram coradas positivamente para pan-CK (Figura 9A, B). coloração fortemente positiva de CK19 foi visto em células JE (Figura 9C), mas apenas um pequeno número de células dispersas foram coradas OGE positivo (Figura 9D); A mancha CK10 /13, de ambas as células JE e OGE eram fracos positivo ou positivo (Figura 9E, F); Além disso, as duas células tipos foram espalhados positivamente coradas com CK16 (Figura 9G, H). Os controles negativos não foram coradas em todas as condições (Figura 9i, J). Figura 9 imuno-coloração de células JE e OGE (células segunda passagem, SP × 400). células A. je, CK-Pan positiva; células B. OGE, CK-Pan positiva; células C. JE, CK19 fortemente positiva; células D. OGE, CK19 em um pequeno número de células positivas espalhadas; E. JE células, CK10 /13 fracamente positivo para positivo; F. OGE células, CK10 /13 fracamente positivo para positivo; células G. JE, CK16 espalhados positiva; células H. OGE, CK16 espalhados positiva; células I. je, controle negativo; células J. OGE, controle negativo.
observação TEM da formação de JE apego células para erradicar fatias
Finalmente, a formação de fixação entre as células JE e superfície do dente foi estudada por um modelo de co-cultura. células JE e fatias de raiz foram co-cultivadas in vitro. Em seguida, foram observadas células JE na superfície cemento humano. Três dias após a inoculação, as células eram esféricas e não totalmente esticado (Figura 10A); Cinco dias mais tarde, o número de células na superfície JE cemento aumentada e uma porção de células foram esticados (Figura 10B); Aos 7 d, as células JE foram totalmente esticado para ser de forma plana, ligado à superfície do cemento com a membrana celular, mas não pareceu clara da membrana basal e estruturas hemidesmossoma-like (Figura 10C); Às 9 d, as células JE parecia ter um pequeno número de depósitos elétron-densas como hemidesmossoma na membrana celular local ligado à superfície cemento (setas, Figura 10D); Em 11-14 d, houve um aumento significativo do número de células em fatias de raiz, e células multi-camada apareceu (Figura 10E). Além disso, um grande número de depósitos densos em electrões apareceu na junção da superfície da membrana da célula-cemento. Finalmente, membrana basal-like e estruturas hemidesmossoma-like foram formados (setas, Figura 10F). A Figura 10 observações por MET da formação estrutural de JE fixação células à superfície do cemento. A. No 3 d, houve um pequeno número de células na superfície do cemento, as células eram esféricas, não esticar (MET × 13500); B. Em 5 d, células na superfície do cemento aumentaram em número, e uma porção de células esticado (MET × 9700); C. Em 7 d, as células completamente esticado para ser de forma plana, e ligado à superfície do cemento, mas não formam as estruturas da membrana basal, como e-hemidesmossoma semelhante claros (MET × 24500); D. Às 9 d, as células JE parecia ter um pequeno número de depósitos elétron-densas como hemidesmossoma na membrana celular local ligado à superfície cemento (setas, TEM × 33000); E. Em 11-14 d, houve um aumento significativo no número de células na superfície do cemento, e células multi-camada apareceu (MET × 7400). F. um grande número de depósitos densos em electrões (setas) apareceu na junção da superfície da membrana de células JE-cemento, formando as estruturas de membrana basal e semelhantes hemidesmossoma-like (TEM × 46000).
Discussão
JE é um tecido gengival humano único epitélio
de acordo com a observação de tecidos, descobrimos que JE tecido humano normal pertencia ao epitélio estratificado simples. As células eram homogéneas quanto à forma, relativamente mais baixo na diferenciação, sem queratinização e cristas epiteliais in vivo. Isto é provavelmente devido à sua localização na parte inferior do sulco gengival, ligação à superfície do dente e raramente era sujeito a estimulação externa. No entanto, a SE e OGE são expostos ao ambiente de cavidade oral e exibem características típicas de células escamosas do epitélio. Eles foram polígono em forma, bem alinhados, queratinizado na camada superficial com cristas epiteliais densas que se projetavam para o tecido conjuntivo, e apresentar uma clara fronteira com JE. Em experiências preliminares, cristas epiteliais também foram vistos em JE de atrofia gengival ou bolsas periodontais. Isto sugere que a estimulação externa e inflamação pode resultar na formação de cristas epiteliais. Além disso, os resultados da análise da imagem mostrou que JE foi apenas cerca de 1 mm de comprimento, 60 mm de largura, e de 15 a 20 camadas de células de profundidade. Este resultado mostrou que o volume de tecido JE foi extremamente pequenos e difíceis de recolher, que é uma das principais razões pelas quais JE é difícil de estudar. Por outro lado, as células JE e OGE foram isoladas e cultivadas in vitro. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.
