Abstract
Fundo
carcinoma de células escamosas oral (CCEO) está associada a uma taxa de sobrevida em 5 anos pobres. Em geral, os pacientes diagnosticados com tumores pequenos têm um bastante bom prognóstico, mas alguns pequenos tumores têm um comportamento agressivo, levando à morte precoce. Existem, actualmente, não há biomarcadores prognósticos fiáveis para câncer oral. Assim, para optimizar o tratamento para o paciente individual, há uma necessidade de biomarcadores que possam prever o comportamento do tumor.
Método
No presente estudo o potencial valor prognóstico da plectina foi avaliada por um tissue microarray (TMA) imuno-histoquímica baseado análise do tecido do tumor primário obtido a partir de uma coorte norueguesa do Norte de 115 pacientes diagnosticados com CEB. A expressão de plectina foi comparada com as variáveis clínicas e sobrevida de 5 anos.
Resultado
A análise estatística revelou que a baixa expressão de plectina nas células tumorais previu um desfecho favorável para pacientes com doença não metastática (p
= 0,008). Além disso, foi encontrada a expressão da plectina correlacionar (p
= 0,01) com a expressão de uPAR, que nós encontramos anteriormente de ser um potencial marcador de prognóstico para tumores T1N0.
Conclusões Os nossos resultados indicam que baixa expressão de plectina prevê um desfecho favorável para os pacientes com CEB não metastático e do nível de plectina expressão pode, portanto, ser utilizados na estratificação de tratamento para pacientes com doença em estágio inicial.
Fundo
carcinoma de células escamosas contas (SCC) para mais de 90% das neoplasias malignas da cabeça e pescoço [1, 2]. Cabeça e pescoço SCC (CECP) têm uma taxa de sobrevivência de 5 anos de aproximadamente 50%, [3, 4] e está classificada como a oitava causa de morte por câncer em todo o mundo [5].
CCEO inclui tumores localizados no celular língua, assoalho da boca, mucosa bucal, borda gengival e do palato duro e mole. A classificação do sistema de CCEO mais utilizado é o TNM-sistema pela União de Controle do Câncer Internacional [6]. Este sistema é utilizado para descrever a extensão anatómica da doença no diagnóstico com base no tamanho do tumor primário e a extensão do crescimento do tumor (T), linfonodo regional metástase (N) e metástases à distância (H), e é a base para a fase agrupamento destas pacientes [7, 8]. Por avaliação morfológica, os tumores são classificados assim, moderada e pouco diferenciado [1]. A TNM-classificação, e, em menor medida, do grau de diferenciação, são muitas vezes utilizados como preditores de resultado. No entanto, carcinoma epidermóide estudados são molecularmente heterogênea e tumores com idêntica TNM-classificação e grau de diferenciação podem diferir em agressividade e resposta ao tratamento [7, 9]. Este comportamento imprevisível aumenta a necessidade de uma ferramenta de diagnóstico que pode proporcionar informação de prognóstico mais fiável.
Um modelo de risco com base em análise histológica dos tumores foi proposto [10-12]. No entanto, em um estudo recente este modelo não prever o resultado de pacientes com carcinoma epidermóide da língua [13]. Vários relatórios anteriores propuseram diferentes biomarcadores, como a p53, EGFR, Ki67 e E-caderina como marcadores prognósticos para CEB, [14-16] embora nenhum tenha sido implementada na prática clínica. Na tentativa de encontrar novos e melhores prognósticos marcadores temos neste estudo incidiu sobre plectina plectina é uma grande proteína do citoesqueleto intracelular ligante (& gt; 500 kDa) que foi encontrado para ser importante na organização do citoesqueleto rede. Ele é expressa na pele normal e no revestimento epitelial do tracto gastrointestinal do tracto, células musculares e células endoteliais dos vasos, [17], bem como no cancro que surgem no esófago, estômago, pulmão, pâncreas e da cavidade oral [17, 18]. Plectina está localizada no lado interno da membrana do plasma onde ele está associado com filamentos intermédia (IF), microtúbulos e microfilamentos [19]. Em hemidesmossomas, plectina interage com a cauda citoplasmática da subunidade de integrina β4. Defeitos no gene plectina foram encontrados na grave, hereditária, a formação de bolhas hereditária doença epidermólise bolhosa simples, enfatizando a importância da proteína em células epiteliais normais [20]. Plectina afecta as propriedades mecânicas, dinâmicas, bem como do citoesqueleto, e (pelo menos em queratinócitos) plectina-deficiência foi mostrado para resultar num aumento das taxas de migração provavelmente através da activação da ERK1 /2 via [21]. Em um estudo que investigou HNSCC, Katada et al. descobriram que a taxa de sobrevivência de pacientes com elevada expressão plectina em suas células cancerosas diminuiu significativamente, bem como a frequência de recidivas aumentou significativamente, em comparação com pacientes com expressão plectina baixo [22].
Em um estudo recente que mostrou que a uroquinase receptor do ativador do plasminogênio (uPAR) e ativador do plasminogênio inibidor-1 (PAI-1) podem ser marcadores prognósticos em CCEO fase inicial [23]. uPAR é um componente do sistema de activador de plasminogénio (PA), e tanto o activador do plasminogénio uroquinase (uPA) e uPAR estão ligados ao aumento da actividade proteolítica e migração de células cancerosas. uPA converte plasminogénio em plasmina da protease da serina activa, uma protease de largo espectro, que pode degradar muitos tipos diferentes de proteínas de matriz extracelulares, além de activar latente factores de crescimento e metaloproteases da matriz [24, 25]. Através da ligação de uPAR a uPA para, as células cancerígenas podem dirigir a actividade proteolítica para a superfície da célula [26]. Tal como acontece com plectina, o aumento da expressão de uPAR tem sido associada com a transição epitelial-mesenquimal fenómeno (EMT) [27-29].
Neste estudo baseado em TMA, baixa expressão de plectina foi encontrado para ser um marcador para uma prognóstico favorável em CCEO não metastático. Plectina e uPAR mostrou padrões de coloração semelhantes nos tumores e houve uma correlação significativa entre plectina e expressão uPAR.
Métodos
espécimes
Este foi um estudo retrospectivo utilizando fixados em formalina, amostras de tumores embebidos em parafina de 115 pacientes com histologicamente verificada CCEO primário no período 1986-2002 coletados dos arquivos do Departamento de Patologia Clínica do Hospital Universitário do Norte da Noruega. Para garantir uma coorte homogénea, foram excluídos tumores com padrões de crescimento verrucoso, bem como tumores de pacientes com cancro da anterior, ou a radioterapia prévia para a área da cabeça e pescoço. Todos os pacientes apresentaram doença primária localizada na cavidade oral, incluindo língua móvel, assoalho da boca, mucosa bucal, gengiva e palato duro e mole. dados clínicos relevantes e TNM-classificação foram recuperados de arquivos dos pacientes, incluindo relatórios de patologia, Estatísticas da Noruega e da Causa de Registro Morte. Os status N e M foram determinados por meio de exame clínico e radiológico. O tecido normal língua mucosa foi obtido a partir do tecido adjacente ao tecido do tumor. O estudo foi aprovado pelos Comitês Regionais de Medicina e Saúde de Ética em Pesquisa, Norte da Noruega (nº 22/2007). A informação do paciente foi de-identificados antes da análise. O comitê de ética, não era necessário obter por escrito ou consentimento alegações das pacientes participantes. Microarray
tecido (TMA)
Uma região morfologicamente representante de cada tumor foi identificado em um hematoxilina e eosina (HE) de slides -stained e núcleos para o TMA foram colhidas a partir do bloco de tecido correspondente usando um tecido Arrayer Beecher Instruments Micro. Oito núcleos de 0,6 mm foram retiradas das regiões seleccionadas do bloco dador de cada tumor e inseridos em blocos de parafina receptor de microarray. Quatro mm de espessura do, embebidos em parafina de tecido TMA fixa foram cortadas com um micrótomo e colocadas em lâminas Superfrost. HE-coloração e citoqueratina-coloração imuno-histoquímica foi realizada para verificar a presença de tecido tumoral.
Nós experimentaram uma perda de 16,5% dos núcleos durante a preparação, e os núcleos de conservas, 8,4% continham muito poucas células tumorais a ser avaliada . Esta perda devido a problemas técnicos é moderado em comparação com outros relatos [30, 31]. De cada paciente uma média de 3,82 núcleos corados e avaliados para a expressão plectina.
Avaliada a partir de cada paciente foi 3,82.
Imuno-histoquímica (IHQ)
Todas as lâminas foram deparaffinised e reidratadas. A recuperação de antigénios plectina foi reforçada por fervura num sistema pressurizado com tampão de citrato 10 mM (pH 7,0). Além disso, as lâminas foram incubadas 30 min com 3% H
2O 2 para bloquear a actividade da peroxidase endógena, e incubadas uma hora com soro de cabra a 10% (Dako, Glostrup, Dinamarca) em tampão fosfato salino (PBS) ( Dako, Glostrup, Dinamarca) para reduzir a coloração inespecífica. Coelho anticorpo monoclonal primário contra plectina (ab32528, Abcam, Cambridge, MA) foi diluída 1: 200 em diluente de anticorpo Dako (S3022, Dako, Glostrup, Dinamarca), e incubadas durante a noite a 4 ° C. Posteriormente, os anticorpos ligados foram visualizados utilizando o anti-coelho Envision Além disso System (K4011, Dako, Glostrup, Dinamarca). As lâminas foram lavadas em PBS w /0,1% de Tween-20 com concentrações elevadas de sal (NaCl 0,4 M) e pH 6,0 (PBSTS6) após incubação com anticorpos primários e secundários.
O anticorpo anti-plectina (ab32528 ) foi anteriormente descrito e validada como um bom marcador para o adenocarcinoma pancreático [18]. Como um controlo negativo, tecido de carcinoma de pâncreas foi tratada de acordo com o mesmo protocolo de coloração, mas o anticorpo primário foi omitido. Nenhuma coloração foi observada indicando que o anticorpo secundário não deram coloração inespecífica no tecido (dados não mostrados).
Coloração de mucosa oral normal apresentou coloração específica e forte de tecido muscular em vasos sanguíneos, que serve como controlo positivo.
a coloração uPAR foi realizada de acordo com a anterior descreve protocolos [23].
imuno-histoquímica de pontuação
Todos os núcleos foram examinados por um patologista experiente (SES) e um cirurgião de cabeça e pescoço treinados (OR) sem o conhecimento do resultado clínico. A pontuação foi semi-quantitativo, [32, 33] e o índice de coloração (SI), calculado como o produto de intensidade da coloração (nenhum (0), fraca (1), moderado (2) ou forte (3)) e a proporção de células tumorais positivos (sem coloração (0), & lt; 10% (1), 10-50% (2), 51-80% (3) ou & gt; 80% (4)). Assim, o SI para cada núcleo difere de um valor mínimo de zero para um máximo de 12, e pontuação final do paciente era o SI média de todos os núcleos avaliadas. Tumores com pontuação acima do valor médio foram classificados como altos expressadores ', enquanto aqueles com pontuação abaixo do valor médio foram classificados como tendo uma baixa expressão do biomarcador.
De imunofluorescência (IF)
Para se a análise das lâminas foram pré-tratados como descrito no protocolo IHC para plectina. Um anticorpo policlonal de coelho anti-plectina (ab83497, Abcam, Cambridge, MA) recomendado para IF foi usado. O anticorpo foi diluído 1:10 em diluente de anticorpo Dako (S3022, Dako, Glostrup, Dinamarca) e incubadas durante 3 h à temperatura ambiente. Após as lâminas foram lavadas com PBSTS6, que foram incubadas durante a noite a 4 ° C com o anticorpo monoclonal de ratinho anti-humano uPAR (# 3936, Sekisui Diagnostica, Stamford, CT, EUA) a uma diluição de 1:10 num tampão de 10 % de soro de cabra (Dako América do Norte, Carpintera, CA, EUA) em PBS com 1% de BSA e 0,3% de Tween-20, pH 6,0. Após a incubação as lâminas foram lavadas com PBSTS6. Os anticorpos secundários (Alexa Fluor 488, de coelho anti-cabra, A11034 e Alexa Fluor 647, ratinho de cabra-anti, A21236, Invitrogen, Carlsbad, CA) foram misturadas e diluídas 1: 200 em PBS. As lâminas foram montadas e contrastadas com DAPI Antifade (DAPI em Fluorgard, 0,5 g /ml, Insitus, Albuquerque, NM) e selado com unha polonês. As lâminas foram observadas e fotografadas utilizando Leica TCS SP5 microscópio confocal de laser Leica com software de aplicação Advanced Suite fluorescência (Leica Microsystems AG, Wetzlar, Alemanha).
A especificidade do anticorpo policlonal anti-plectina (ab83497) utilizado na coloração por imunofluorescência foi testada por coloração adenocarcinoma pancreático. Semelhante ao anticorpo monoclonal anti-plectina, o anticorpo anti-plectina policlonal especificamente coradas células de cancro do pâncreas. Além disso, a transferência de Western de lisado de células de músculo inteiro mostraram que o anticorpo deu uma banda de aproximadamente 500 kDa correspondente ao tamanho de plectina (dados não mostrados). Estatísticas
Todos os dados foram tabulados e analisados usando o programa SPSS IMB estatísticas (Chicago, IL), versão 21. as associações entre diferentes variáveis categóricas foram avaliadas por meio do teste do qui-quadrado de Pearson. análises univariadas de influência das diferentes variáveis a tempo de sobrevida específica da doença foram realizadas utilizando o método de Kaplan-Meier, e a significância estatística entre as categorias foi estimada pelo teste de log-rank. valores estatisticamente significativos de Cox análises univariadas foram inseridos em uma análise multivariada utilizando o modelo de regressão de Cox backward. Morte pela doença (DSD) foi definida como pacientes morrendo forma CCEO e não de condições não relacionadas. Estes dados foram obtidos a partir da "Causa da Morte de registro na Noruega. Correlação entre bivariates foi calculado com rho de Spearman. O ponto de corte para baixa e alta expressão para cada biomarcador foi fixada no valor médio de pontuação final do paciente, e foi 5,60 para plectina e 5,63 para uPAR. Todos os resultados foram considerados significativos se p Art & lt; 0,05, e indicada em conformidade com as diretrizes observação de McShane et al. [34] O ponto de partida foi definida como momento do diagnóstico, e no último dia de acompanhamento foi de 01 de janeiro st, 2012.
Resultado
No presente estudo o valor prognóstico da plectina em CCEO foi avaliada por uma análise imuno-histoquímica com base em TMA de tecido de tumor primário obtido a partir de uma coorte norueguês do Norte de 115 pacientes. A coorte consistiu de 64 homens e 51 mulheres, com uma idade média de 65,2 anos (homens 64,4 /mulheres 66,0) no momento do diagnóstico [23]. A maioria dos casos apresentados com tumores pequenos (T1, 34% ou T2, 37%), sem metástase ganglionar (N0, 63%) e um tumor bem ou moderadamente diferenciado (90%). Como esperado, o tamanho do tumor (T) ea presença de metástase ganglionar (N +) correlacionou-se significativamente com a doença de morte específico (DSD), enquanto o grau de diferenciação não o fez.
Padrão de coloração imuno
plectina língua normais dificilmente manchado mucosa que serviu como material de controlo, enquanto que os vasos sanguíneos no estroma subjacente indicado coloração mais forte (Fig. 1a). Em plectina-positiva OSSC tumores da coloração foi relativamente homogénea em todo o tumor (Fig. 1b). As células cancerosas foram altamente positiva enquanto a matriz extracelular adjacente apresentaram menor reatividade. A coloração das células cancerosas foi confinada principalmente à membrana do plasma (fig. 2), mas a coloração citoplasmática também foi observado em uma relativamente grande proporção dos núcleos. FIG. 1 imuno-coloração para plectina da mucosa da língua normal (a) e carcinoma de células escamosas oral (b). A mucosa normal mostrou apenas coloração fraca enquanto os vasos sanguíneos no estroma foram fortemente coradas. A coloração de células tumorais positivas plectina era forte, e o estroma mostrou quase nenhuma coloração
fig. 2 padrão de coloração Immunhistochemical em núcleos TMA de carcinoma epidermóide oral. Plectina coloração foi principalmente na membrana plasmática, mas também alguma coloração citoplasmática foi visto
Survival
Para pacientes sem metástase ganglionar (N0), em qualquer T-estágio, o risco de morrer da doença no prazo de 5 anos foi significativamente diminuída em pacientes com tumores de baixo plectina expressa em comparação com aqueles com expressão plectina elevada (p = 0,008
) (Tabela 1 e Figura 3). Além disso, para os doentes com tumores T1-independentes, de N-estado, as análises estatísticas revelaram um risco significativamente reduzido de DSD em aqueles que tinham tumores com expressão baixa plectina (p = 0,031
). Como esperado, dados os resultados anteriores, os pacientes com tumores T1N0 com baixa expressão plectina teve um excelente resultado, como todos estes pacientes ainda estavam vivos após 5 anos (p
& lt; 0,001). Em uma análise multivariada dos N0-casos incluindo plectina eo tamanho do tumor (T1 vs T2-4), única expressão alta plectina foi um preditor independente significativo de aumento da DSD (p = 0,014
, HR 3,674, IC 95% 1.305- 10,344) .table 1 Expressão de plectina em toda a coorte, o N0, T1 e pacientes T1N0, no momento do diagnóstico. O número de pacientes com uma doença específica morte cinco anos (DSD) é dada em números e também como porcentagem do total em cada grupo do total em cada grupo
plectina
baixa expressão
alta expressão
DSDP
Todos os doentes a
N (% do total)
55
56
5 anos DSD
19 (35%)
25 (45%)
0,198
N0-casesb
N (% do total)
36
32
5 anos DSD
5 (14%)
13 (41%)
0,008 *
T1 -casesc
N (% do total)
23
16
5 anos DSD
2 (9%)
6 (38%)
0,031 *
T1N0-casesd
N (% do total)
19
9
5 anos DSD
0
4 (44%)
& lt; 0,001 *
número atotal dos pacientes incluídos na análise foi de 111
número btotal dos pacientes incluídos na análise foi 68
número cTotal dos pacientes incluídos na análise foi 39
número dtotal dos pacientes incluídos na análise foi de 28
* p Art & lt; 0,05 foi considerado estatisticamente significativo, e em destaque na boldsface quando presente
Fig. 3 de Kaplan-Meier. A figura ilustra a diferença na sobrevivência entre N0-pacientes com alta e baixa expressão de plectina respectivamente
Correlação de plectina e expressão uPAR
Temos demonstrado recentemente que pacientes com tumores T1N0 expressar baixos níveis de uPAR tem uma DSD significativamente reduzida em comparação com aqueles com uma expressão maior de uPAR. Para investigar a distribuição de expressão do uPAR e plectina nos tumores que fizemos um teste qui-quadrado, e descobriu que um número significativo dos tumores que eram altos expressadores de uPAR também foram elevados expressadores de plectina, e aqueles com baixa expressão de uPAR geralmente eram baixos expressadores de plectina. Essa correlação foi significativa com um coeficiente de correlação de 0,769 (p
= 0,01) como mostrado em um gráfico de dispersão na Fig. 4. coloração por imunofluorescência dupla foi realizada em alguns tumores seleccionados para investigar se plectina e uPAR foram co-localizados dentro das mesmas células, a co-expressos pelas mesmas células, ou localizado para as mesmas regiões tumorais. A imunofluorescência mostrou que o plectina e coloração uPAR foi localizada nas mesmas áreas do tumor (Fig. 5). Como esperado, a coloração por imunofluorescência confirmou que plectina foi encontrado principalmente na membrana plasmática, enquanto uPAR foi localizada principalmente no citoplasma. FIG. lote 4 Scatter de uPAR e pontuação plectina para toda a coorte. Houve uma correlação significativa (p
= 0,01) entre a plectina ea pontuação uPAR. As linhas cinza claro na figura representam o intervalo de confiança de 95%
Fig. 5 Imunofluorescência coloração de tecidos de carcinoma de células escamosas oral. A maioria das células foram positivas para ambos plectina e uPAR. Plectina (verde) está localizada principalmente na membrana plasmática e a periferia da célula, enquanto uPAR (vermelho) é mais proeminente na parte citoplasmática das células. Plectina é altamente expressa na parede dos vasos sanguíneos (asterix
)
Discussão
A cirurgia é o principal tratamento para o câncer na cavidade oral, e é muitas vezes combinada com radioterapia, enquanto a quimioterapia é mais frequentemente aplicada como tratamento paliativo na fase final do tratamento [35-37]. Os efeitos colaterais do tratamento para o cancro oral pode ser devastador para a qualidade de vida do paciente, [38] e, portanto, é importante para evitar overtreatment prejudicial com radioterapia de pacientes com tumores pequenos com prognóstico favorável. As decisões relativas à extensão do tratamento de pacientes com CEB fase inicial são muitas vezes difíceis. Ainda assim, a escolha do tratamento é baseada principalmente na TNM-estágio que não discrimina entre tumores agressivos e mais indolentes. Vários estudos sobre potenciais biomarcadores para estratificação de tratamento têm mostrado resultados promissores, mas até agora nenhum desses biomarcadores têm sido implementadas na prática clínica. No presente estudo, investigamos o papel potencial da plectina como um biomarcador de prognóstico. Para o nosso conhecimento, o valor prognóstico da plectina no carcinoma epidermóide estudados anteriormente, só foi estudada por Katada et al. que investigaram uma coorte de 62 HNSCC, entre os quais 23 a partir da cavidade oral [22]. Embora a coorte foi pequeno e heterogéneos, eles descobriram que a sobrevivência foi significativamente reduzida quando as células tumorais expressaram niveis elevados de plectina. A nossa coorte é maior e composto apenas de tumores da cavidade oral e, portanto, mais homogénea. De acordo com os resultados de Katada et al., Verificou-se que a baixa expressão de plectina nas células tumorais prevê um resultado favorável, mas apenas em pacientes com doença fase precoce.
Anteriormente encontrado que a baixa expressão de uPAR correlacionada com reduzida DSD para pacientes com tumores com tumores T1N0, e que uPAR, portanto, pode ser um marcador de prognóstico adequado para este subgrupo de pacientes [23]. No presente estudo, encontramos uma correlação altamente significativa entre a expressão de plectina e uPAR. No entanto, em contraste com uPAR, elevada expressão de plectina significativamente correlacionada com a DSD em todos os pacientes com doença não metastático, e não só o subgrupo T1N0.
A maioria das células de tumor que expressam uPAR plectina também expressa. Sugeriu-se anteriormente que a expressão aumentada de uPAR em células tumorais está associada a EMT [27, 29, 39]. Pouco se sabe sobre plectina e EMT, mas a formação de podosomes contendo plectina tem sido proposta como um primeiro passo para EMT em CCEO [40].
Conclusão
O presente estudo mostrou que a baixa expressão de plectina prever um desfecho favorável para os pacientes com doença não metastático. Além disso, todos os pacientes com doença T1N0 e baixa expressão de plectina, sobreviveram durante mais de 5 anos. Embora os resultados devem ser validados em coortes maiores, eles sugerem plectina como um biomarcador prognóstico promissor, o qual pode ser utilizado para orientar a estratificação de tratamento para pacientes com CEB não metastático
abreviações
DSD:.
morte pela doença
EMT:.
transição epitelial-mesenquimal
HNSCC:
cabeça e pescoço carcinoma epidermóide
CEB: carcinoma de células escamosas oral
TMA:
Tissue microarray
TNM: sistema de classificação
para avaliar a extensão da metástase de tumor primário linfonodos regionais e metástases à distância
uPAR: receptor do ativador do plasminogênio
uroquinase
Declarações
Agradecimentos
Agradecemos Bente Mortensen, Eli Berg e Magnus Persson pela excelente assistência técnica e Inger Sperstad para obter ajuda com a criação de banco de dados. Além disso, agradecemos Bodil Fadnes para assistência com imunofluorescência e questões técnicas. Este trabalho foi apoiado Os norte-norueguesa regionais de saúde e UiT O Artic Universidade da Noruega, sendo ambas organizações sem fins lucrativos
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concorrentes. interesses
os autores declaram que não têm interesses conflitantes. contribuições
dos autores
OGR recolhidos do material, realizadas coloração imuno-histoquímica e imunofluorescência, interpretado de dados, realizada análise estatística, e elaborou o manuscrito. SNM realizada coloração imuno-histoquímica, interpretado de dados e elaborou o manuscrito. Gs e EHO participou no desenho do estudo, contribuíram para interpretação dos dados, e criticamente revisto o manuscrito. LUH concebeu o desenho do estudo, contribuíram para interpretação dos dados, e criticamente revisto o manuscrito. SES participou no desenho do estudo, contribuíram para interpretação dos dados, realizada análise estatística, e revisto o manuscrito de forma crítica. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.
