Abstract
Fundo
O objetivo do presente estudo foi examinar as respostas in vitro de células ERM sob a combinação de centrífuga e as forças de compressão, em termos de expressão de ARNm de HSP70.
Métodos
as células ERM foram positivas para CK19 indicando que eles eram derivados a partir do epitélio odontogénica. células MTC cultivadas foram aplicados força centrífuga e força de compressão de uma a três vezes como forças mecânicas. Após a adição das forças, as culas foram observadas utilizando microscopia electrónica de varrimento (SEM) e foram medidos de expressão de ARNm de HSP70 por RT-PCR. Os resultados
observações SEM mostrou que as células foram destruídas imediatamente após a aplicação de força mecânica, mas saliências nucleares recuperado o mesmo que o controlo 3 h mais tarde. A expressão significativamente mais elevada de ARNm de HSP70 foi observada em células MTC sob força mecânica em comparação com o controlo, mas diminuiu gradualmente com o tempo. Não ocorreu acumulação de expressão de ARNm de HSP70 ocorreu com força intermitente. No entanto, a expressão de mRNA HSP70 com força intermitente repetidos 3 vezes foi significativamente maior em comparação com a força intermitente aplicada apenas uma ou duas vezes.
Conclusões
Estes resultados sugerem que as células MTC expressam mRNA HSP70 em resposta a forças mecânicas, e que força intermitente mantém o nível de expressão de ARNm de HSP70. Palavras-chave
HSP70 epitelial resto de Malassez força mecânica no fundo centrifugação vitro
sabe-se que o espaço do ligamento periodontal (PDL) é mantida ao longo da vida. Alguns estudos relatam que o resto epitelial de Malassez (MTC) mais provavelmente contribui para a manutenção da largura PDL [1]. O MTC é separado da bainha epitelial de Hertwig (dela) na fase embrionária de desenvolvimento da raiz do dente. DELA células estreitamente relacionados e estão rodeados por uma membrana basal contínua. Quando as células da papila dentários estão ligados ao dela, a membrana basal interna do RAF é intermitente imediatamente após as células começam a sintetizar uma matriz de dentina. células saco dental, em seguida, migrar entre os DELA fragmentados [2]. Após o cemento sintetizados por estas células mesenquimais do saco dental, células epiteliais agregam-se para formar agregados de células com o nome do MTC, os quais são outra vez rodeado por uma membrana basal contínua e geralmente estão localizados perto da área do cemento na PDL ou no cemento após o erupção dos dentes, e não estão relacionadas com o envelhecimento [3]. Carrie e Katchburian relataram que a apoptose de células ERM pode ser parte do mecanismo de rotação do MTC [4]. Muitos estudos têm relatado tanto o morfológica e alterações funcionais de células ERM sob várias condições in vivo [5-7]. Inoue et al. relataram que a regeneração quando ocorreu uma cavidade-PDL-dente osso alveolar foi preparado, no entanto, anquilose dento-alveolares ocorreu 2 meses após a operação. Eles observaram que nenhum ERM existe no PDL regenerado e concluíram que a ausência da ERM deve estar relacionado com anquilose dento-alveolar [5]. Além disso, Yamashiro et al. relatado que a denervação do nervo alveolar inferior leva a uma distribuição reduzida do MTC em 1 semana e anquilose dento-alveolar ocorre em 6 semanas. Eles também confirmou que o receptor de MTC era imune positiva para trkA, que mostra uma alta afinidade para o receptor de NGF e concluíram que o nervo sensorial pode desempenhar um papel regulador na manutenção da ERM [6]. Mina et al. observado o processo de cicatrização da PDL após dente re-plantação em ratos e comparado ao grupo ocluída com o grupo não ocluída. Eles descobriram que dento-alveolares anquilose foi claramente detectado no grupo não-ocluída, mas não foi detectada no grupo ocluída. Eles concluíram que os estímulos oclusais promover a regeneração de PDL e prevenir a anquilose dento-alveolares [7]. Estes fatos sugerem que a redução da distribuição de ERM no PDL pode preceder o desenvolvimento de anquilose dento-alveolar e que estímulos mecânicos devem impedir dento-alveolar anquilose. No entanto, poucos estudos têm sido relatados sobre as mudanças da ERM sob os vários tipos de forças mecânicas in vitro [8].
Em geral, a resposta ao estresse é considerado para representar um mecanismo de defesa celular contra perturbações ambientais [9- 12]. Se as células são expostas quer a uma ligeira ou uma tensão moderada, que seja suficiente para regular a expressão de proteínas de choque térmico (HSPs), eles são muitas vezes capazes de sobreviver subsequente, caso contrário, estímulos de stress letais. As HSPs podem ser expressos por todos os tipos de células e que desempenham um papel de protecção contra uma variedade de factores, incluindo oxidantes nocivos, inflamação, hipoxia, hipertermia e também estímulos mecânicos incluem força ortodôntico [10-14]. Além disso, força ortodôntica apoptose induzida forte de fibroblastos PDL, e muitas células MTC também caiu na apoptose [15, 16]. Confirmou-se que a HSP70, que serve para manter a homeostase foi actuou como um cochaperone por Hsp40, pode inibir a apoptose, interferindo com a função de factor indutor de apoptose (FIA) [17]. O efeito de HSP70 em apoptótica facor-protease activadora de 1 (Apaf-1), provavelmente, responsável pela sua capacidade de proporcionar resistência à apoptose induzida por stresse relataram a sua expressão e existe no PDL ao longo da vida [18]. A finalidade da
o presente estudo foi examinar as respostas das células MTC sob forças mecânicas in vitro, em termos da expressão de mRNA que codifica para HSP70, que é uma proteína de resistência ao estresse.
Métodos
cultura celular
células Porcina ERM estavam doada pelo Prof. Yoshihiro Abiko (Patologia Oral da Hokkaido University Medical Science). As células de ERM foram cultivadas em meio mínimo essencial (MEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e gentamicina em 75 placas de cultura mm numa atmosfera humidificada de 95% de ar e 5% de CO
2 a 37 ° C. Depois de sub-cultura 3 vezes, as células do MTC foram inoculadas em 35 mm pratos. Quando as células foram cultivadas durante 7 dias e atingiu 70% de confluência, foram utilizadas para as experiências
experimento exploratório:. A determinação da força mecânica in vitro (Fig. 1)
fig. 1 ilustração mostra os métodos de aplicação de força mecânica. Para a centrifugação, o rotor roda a 4800 rpm durante 20 min para carregar a força mecânica (Tipo 1). Para a força de compressão, uma tampa de vidro, de 24 x 24 mm2, 0,2 g de peso, foi colocado sobre a superfície da célula durante 20 minutos (Tipo 2). Combinação do Tipo 1 e Tipo 2 (Tipo 3)
Tipo 1: A força centrífuga (4.800 rpm) por 20 min (n
= 4)
Tipo 2: Comprimir vigor (20 min) (n
= 4)
Tipo 3: a compressão vigor + a força centrífuga (4.800 rpm) por 20 min (n
= 4)
por força centrífuga, foram utilizados rotor de microplacas horizontal em uma centrífuga Hitachi (HimacCT6D®) . O experimento centrífuga referido por Redlish et ai. estabelece um modelo de pressão por centrifugação das células PDL in vitro [19, 20]. Depois de as placas de cultura de 35 mm foram inseridos no adaptador do rotor, o dispositivo foi fixado a uma força centrífuga de 4800 rpm (47,2 kPa, 482 g /cm 2), que é quase o mesmo que uma força de expansão rápida [13 ]. Compra de compressão força, uma tampa de vidro, 24 x 24 mm 2 em tamanho e 0,2 g de peso, foi colocado diretamente na superfície da célula (Fig. 1). Não houve nenhum relatório sobre a força centrífuga com materiais de compressão. Hoshina et ai. usados 9,0 g placa de vidro, no entanto, as células sob a placa de vidro com a força centrífuga resultou a morte [14]. Então tentamos encontrar força de compressão adequada abaixo de 0,2 g tampa de vidro.
Para a combinação de compressão e força centrífuga, uma tampa de vidro (24 x 24 mm 2, 0,2 g) foi colocado diretamente sobre as células e foi removidos após centrifugação a 4800 rpm.
As células em cada um dos 3 tipos acima foram cultivadas continuamente durante 12 h e sem qualquer força foi utilizado como controlo.
como um resultado, o tipo 3 mostrou uma expressão significativamente mais elevada de ARNm de HSP70 de o controlo, tipo 1 e tipo 2 (Fig. 2). Assim, decidimos usar o grupo de centrifugação e tampa de vidro combinados como o grupo experimental. FIG. 2 Expressão de ARNm de HSP70 no 3 h após diferentes estímulos mecânicos. Tipo 3 mostra uma expressão significativamente maior de mRNA HSP70 do que o controle, bem como tipo 1 e tipo tampa 2. Não houve diferença significativa entre o controle, tipo 1 e tipo 2, embora ambos tipo 1 e tipo 2 tendeu a ser maior do que o grupo de controlo. ** P Art & lt; 0,01
eletrônica de varredura microscópica (MEV)
células MTC foram observadas antes, imediatamente após e 3 h após a força mecânica usando uma emissão de campo feixe de elétrons 3D analisador de rugosidade da superfície Elionix ERA-8900FE (4channel 3 dimensional microscópio eletrônico de varredura ( 4CH-3D-SEM, Elionix Co., Ltd., Tóquio, Japão) a uma voltagem de aceleração de 15 kV. para observações SEM, as células foram inicialmente fixadas com glutaraldeído a 2% durante 1 h a 4 ° C. As células foram, então, desidratados numa série graduada de etanol, seca por meio de tetrametilsilano (Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha) e, em seguida, revestida por borrifamento com Au-Pd (Bio-Rad, Tóquio, Japão). A altura das células foi medida como um corte de uma linha sistema na figura contador de linha usando o programa Image J software de análise (NIH, Bethesda, MD, EUA). Experimental Design by
Experiência 1
