dental da arte abstracta
Fundo
Este estudo investigou a prevalência de Enterococcus faecalis
, seus fatores de virulência putativos e susceptibilidade antimicrobiana em indivíduos com e sem doenças dentárias. Um total de 159 amostras de lavagem oral foram coletadas de pacientes (n = 109) que sofrem de doenças dentárias e controles saudáveis (n = 50).
Resultados
E. faecalis
foi detectada usando apenas a cultura em 8 /109 (7,3%) dos pacientes com várias tipos de doenças dentárias, ao passo que não E. faecalis
foi encontrado nos controlos saudáveis do tempo utilizando tanto a cultura e PCR. caracterizações fenótipo das 8 E. faecalis
isolados indicou que 25% dos isolados de hemolisina e 37,5% gelatinase produzido produzidos. A maioria dos genes de virulência importantes; vinculativo proteína colágeno (ace
) e endocardite antigénio (EFAA
) estavam presentes em todos os 8 E. faecalis
isolados, enquanto gene ativador hemolisina (Cyla
) foi detectada apenas em 25% dos isolados, e todos os isolados foram negativos para esp
gene. Todos os E. faecalis
isolados foram 100% sensíveis à ampicilina, cloranfenicol, ciprofloxacina, vancomicina, teicoplanina e, e em menor grau à eritromicina (62,5%).
Conclusão Este estudo mostra que todas as E. faecalis
isolados foram recuperados apenas de pacientes com doenças dentárias polpas especialmente necróticas, e todos os isolados realizada tanto a ligação genes de proteínas e antígenos endocardite e altamente suscetíveis colágeno utilizadas mais frequentemente drogas antimicrobianas na Jordânia.
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Fundo
Muitos estudos demonstraram que E. faecalis
é. frequentemente encontrada em pacientes que sofrem de infecções bucais como gengivite, periodontite, dentes com endodôntico falhou, bem como lesões de cárie ácidas associadas a canais radiculares persistentemente infectados. [1-4] Outros estudos demonstraram a presença frequente de E. faecalis
em associação com uma grande variedade de espécies de bactérias aeróbias e anaeróbias envolvidas em várias doenças endodônticos e periodontite apical crônica [4-7].
Fatores virulentas de E. faecalis incluem
adesão ao tecido hospedeiro, invasão e a formação de abcessos, a modulação da resposta inflamatória do hospedeiro, a secreção de vários produtos, que melhora a formação de biofilme [8-10]. Os dados sobre a prevalência oral de E. faecalis Comprar e seus fatores de virulência variam de um estudo para outro [1, 6, 7]. Portanto, mais investigação sobre potenciais fatores de virulência de E. faecalis
seria útil para compreender o seu papel na infecções dentárias. Além disso, isolados clínicos de E. faecalis
recuperados de infecções do canal radicular pode expressar resistência antimicrobiana aos regimes de tratamento convencionais recomendados para procedimentos odontológicos [11-13].
Este estudo teve como objetivo investigar a ocorrência de E. faecalis
, seus fatores de virulência e susceptibilidade antimicrobiana em associação com e sem algumas doenças dentárias em uma população jordaniana
resultados
Idade dos pacientes variou de 14 a 75 anos (média; 36,4 anos), e as pessoas de controle foram entre 20 e 69 anos (média; 28,3 anos). A prevalência de E. faecalis
isolados de amostras de enxaguamento bucal dos pacientes com doenças dentárias foi 8/109 (7,3%) usando tanto testes de PCR da cultura e, ao passo que todas as amostras de lavagem oral obtidos a partir das 50 pessoas saudáveis de controle foram negativos para E . faecalis
usando ambos os métodos. Todos DNA extraído de 8 E. faecalis
isolados foram provou ser positivo para faecalis
16s gene específico rRNA E.. A diferença entre os resultados dos dois grupos é significativa estatisticamente (valor de P = 0,031). Além disso, houve duas E. avium
isolados (Tabela 1). O padrão de crescimento de E. faecalis
isolado a partir de casos positivos variou de poucos a numerosas colónias (2-50 × 10
3 colónias /ml). A distribuição de 8 E. faecalis
isolados entre os pacientes em associação do sexo, fumadores, de higiene oral e doenças dentárias é mostrada em (Tabela 2). Detecção de genes de factor de virulência putativo entre 8 E. faecalis
isolados utilizando PCR foram como se segue; tanto ace Comprar e EFAA
genes estavam presentes em todos os isolados (100%), enquanto o gene Cyla
foi detectada apenas em 2 isolados, e todos os isolados foram negativos para esp
gene (Tabela 3, Figura 1). Todos os oito E. faecalis
isolados foram 100% susceptível a, ampicilina, cloranfenicol, ciprofloxacina, teicoplanina e vancomicina, enquanto que 62,5% e 12,5% dos isolados eram sensíveis à eritromicina, imipenem, respectivamente, e todos eram resistentes a gentamicina, clindamicina e OxacillinTable 1 Detecção de Enterococcus espécies
em pacientes e controles
Características
109 pacientes com doenças dentárias No. (%)
50 Controles pessoas No. (%)
Idade média (anos)
36,4 ± 13,98
28,3 ± 12,59
Sex
|
Masculino
39 (36)
24 (48)
fêmea
70 (64)
26 (52)
E. faecalis
8 (7.3)
0
E. avium
2 (1,8)
0
Tabela 2 Distribuição de 8 E. faecalis
isola na associação de sexo, tabagismo, higiene oral e doenças dentárias entre os 109 pacientes
Características
E. positiva faecalis
*
negativa E. faecalis
*
total No.
P-value***
Female
7
63
70
0.134
Male
1
38
39
|
Nonsmoker
7
83
90
0.228
Smoker
1
18
19
|
má higiene bucal
7
68
75
0,222
boa higiene oral
1
33
34
|
gengivite + ve
7
64
71
0,161
gengivite ve
1
37
38
|
polpas necróticas
8 **
101
109
0
cárie + ve
4 **
77
81
0,115
cárie -ve
4
24
28
|
* contagem de colônias:. 2 - 50 × 103colonies /ml
** cada um paciente foi tratado com antibióticos durante o último mês.
*** Não significativa entre E. faecalis positiva
e cada um de sexo, tabagismo, higiene bucal, gengivite, cárie, mas significativa, com puples necróticas.
Tabela 3 presença do gene 16S rRNA e prevalência da esp, Cyla, ás, EFAA
genes entre o E. faecalis por via oral 8
isolados detectados por PCR.
Isolar No.
16S rRNA
esp
Cyla
*
ace
EFAA
3
+
-
-
+
+
44
+
-
-
+
+
1
+
-
-
+
+
2
+
-
+
+
+
6
+
-
-
+
+
12
+
-
-
+
+
18
+
-
-
+
+
59
+
-
+
+
+
Total cepas No. (%)
8 (100%)
0 (0,0%)
2 (25%)
8 (100%)
8 (100%)
* Dois isolados expressaram atividade hemolítica in vitro
Figura 1 Distribuição do gene EFAA entre os E. faecalis oral, 8 isolados. M, marcador de DNA de 100 pb; Pista 1, EFAA
(688 pb); controle positivo (E. faecalis
ATCC 29212); Pista 2, EFAA
controle negativo; Lanes 3 a 10, positiva para EFAA
entre E. faecalis por via oral
isolados.
Métodos
Um total de 159 indivíduos que frequentavam a clínica Dental /Hospital Universitário Jordan (JUH), Amman, Jordânia foram examinados para presença de doenças dentárias por dois dentistas (N. Dar-Odeh & amp; O. Abu Hammad) durante o período de estudo de 2005. os pacientes foram divididos em dois grupos de acordo com a presença ou ausência de doenças dentárias. grupo controle consistiu de 50 pessoas saudáveis que não têm qualquer doença dental óbvio. doenças dentárias investigados incluem: cárie dentária, gengivite induzida pela placa bacteriana e doenças do canal radicular. dados pessoais, histórico de tabagismo, presença ou ausência de doença clínico odontológico, higiene oral e tratamento com antibióticos durante o último mês foram registrados para cada pessoa examinada. cárie e gengivite foram registrados como presente /ausente. doença do canal da raiz incluídos: pulpite irreversível, apenas a necrose pulpar e lesão periapical. higiene bucal foi considerada como pobre ou bem de acordo com o índice de placa. Todos os pacientes e pessoas de controle tinham dado o seu consentimento por escrito para ser incluído no estudo. Todos os pacientes e controles foram convidados para enxaguar a boca durante 60 segundos com 10 ml de água destilada estéril e voltou a lavagem oral a um recipiente estéril.
Amostras Processamento
Todas as amostras foram transferidas imediatamente para o Laboratório de Microbiologia Research /Faculdade de medicina /Universidade da Jordânia. espécimes de lavagem oral foi vertida em tubo esterilizado e centrifugou-se durante 10 min a 10.000 g. O sobrenadante foi rejeitado e as peletes restantes foram re-suspensas por vortex em um ml de solução salina normal a 0,9% [14].
Isolamento de espécies de Enterococcus
Um ciclo completo dos peletes suspensos (0,01 ml) foi cultivado sobre bile-esculina ágar placas para detectar e contar a presença de cinza para colónias negras de espécies de Enterococcus
. O resto das amostras suspensas foram armazenadas a -70 ° C para posteriores investigações. Pelo menos três colónias que cresceram em placas de bílis-esculina foram sub-cultivadas em placas de agar de sangue para isolar espécies de Enterococcus
(Oxoid, Inglaterra). Todas as culturas levadas a cabo através do estudo foram incubadas num frasco de vela (5% de CO 2) durante 24-48 horas a 37 ° C. crescimento puro obtido a partir de placas de agar de sangue foi novamente inoculados em cisteína Lactose Electrólito Deficiência (CLED) placas de agar (Oxoid, Inglaterra), 6,5% de solução de NaCl e agar tubo bílis-esculina. Cada mostrando um crescimento cocos Gram-positivos, positivo bile-esculina, testes positivos de 6,5% de NaCl, catalase-negativos e aparecendo como amarelo, pequenos /médios em CLED Agar (Oxoid, Inglaterra) foram registradas provisoriamente como Enterococcus
isolados. E. faecalis
ATCC 29212 foi incluído como um controlo positivo durante todo o estudo.
Detecção bioquímica de E. faecalis isolados
Todos Enterococcus tentativa
isolados foram repicadas no coração cérebro placas de agar infusão (Oxoid, Inglaterra) e testados usando bioquímica sistema Remei (Rapid System ™ STR, EUA) para confirmar sua identidade como E. faecalis
.
hemolisina e atividades gelatinase
E. faecalis
isolados foram avaliados para atividade hemolítica em agar de base de sangue (Oxoid, Inglaterra) suplementado com 5% (v /v) de sangue humano. Uma colónia isolada foi cultivada em placas de agar de sangue e sua atividade hemolítica foi determinada pela presença de zona clara em torno das colônias (P hemólise) conforme relatado por Creti et al
. [15]. actividade de gelatinase foi avaliada por inoculação de colónias simples de cada isolado como forma local, em 12% de gelatina placas (Defico, EUA). As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 48 horas. actividade de gelatinase foi evidente pela presença de zona liquefeito à volta das colónias. mercenses Serratia
ATCC 13880 foi usado como um controle positivo para teste de produção gelatinase.
teste de susceptibilidade antimicrobiana
Susceptibilidade de E. faecalis
isolados de 9 agentes antimicrobianos foi determinada utilizando o método de difusão em disco de acordo com a NCCLS ( agora CLSI) orientações [16].
Detecção de E. faecalis em amostra de lavagem oral por PCR
extração do DNA foi realizada utilizando Assistente de Genomic DNA Purification Kit (Promega, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. As extracções de ADN foram utilizados para detectar os genes de rRNA 16S específicos de E. faecalis
em amostras de lavagem oral [17]. As condições de PCR foram realizadas num termociclador de PCR (MJ investigadores INC, EUA), e foram como se segue: 15 min passo de activação inicial da enzima /de ADN de desnaturação a 95 ° C seguido de 35 ciclos consecutivos a 94 ° C durante 20 s; 68 ° C durante 45 s; 72 ° C durante 15s. Os produtos de PCR foram analisados por electroforese usando 2% de gel de agarose (Promega, EUA) contendo brometo de etídio em tampão 1 x TBE, e funcionar durante 1 h com 70V, e visualizado por UV trans-iluminador (UVP) e do sistema de documentação de gel (UVP) . A mesma reacção de PCR foi testado com cada única estirpe de controlo de E. faecium e S. mutans
que foram isolados a partir de outros espécimes clínicos em JUH, e pela utilização de E. faecalis ATCC 29212.
o teste de PCR utilizado, deu um resultado negativo com DNA extraído de E. faecium
e S. mutans
. Além disso, a extracção do ADN recuperado e identificado de E. faecalis
isolados foram confirmados usando o mesmo procedimento de extracção de ADN e PCR sob as mesmas condições usados para amostras de lavagem oral (Tabela 4) .table 4 susceptibilidade antimicrobiana de 8 E. faecalis
pelo método de difusão em disco
Os agentes antimicrobianos
No. (%) Dos isolados suscetíveis
Ampicilina
8 (100)
cloranfenicol
8 (100)
Ciprofloxacina
8 (100)
teicoplanina
8 (100)
vancomicina
8 (100)
Eritromicina
5 (62.5)*
Gentamycin
Null
Clindamycin
Null
Oxacillin
Null
Abrigou única ace
, EFAA
genes.
Detecção de E. faecalis genes de virulência putativos
DNA de E. faecalis
isolados foi preparada por suspensão de um ciclo completo de colónias de crescimento durante a noite cultivada em sangue agar num tubo que continha 500 ul de água destilada estéril, seguido de fervura durante 10 minutos e depois centrifugou-se a 12000 g durante 6 min. Uma aliquota do sobrenadante (5 ul) foi usado como molde num volume final de 25 ul de mistura de PCR [15]. A amplificação por PCR para os genes seguintes: proteína de ligação a colagénio (ACE
), endocardite antigénio (EFAA
), activador de hemolisina (Cyla
), e uma proteína de superfície (ESP
) foram preparadas como no Uniplex um 25 ul de volume de reacção final. A Tabela 5 mostra os iniciadores utilizados no estudo [15, 17, 18] .table 5 E. faecalis
iniciadores utilizados no estudo
Gene
Sequence
tamanho do produto (pb)
Referência
E. faecalis
16S rRNA
Ef16SF 5 '- CCGAGTGCTTGCACTCAATTGG - 3'
138
17
Ef16SR 5 '- CTCTTATGCCATGCGGCATAAAC - 3'
|
|
Esp
5'-TTGCTAATGCTAGTCCACGACC-3 '
932
18
|
5'-GCGTCAACACTTGCATTGCCGA-3 '
|
|
Cyla
5'-GACTCGGGGATTGATAGGC-3 '
688
15
|
5'-GCTGCTAAAGCTGCGCTTAC-3'
|
|
ace
5'-GGAATGACCGAGAACGATGGC-3 '
616
15
|
5'-GCTTGATGTTGGCCTGCTTCCG-3 '
|
|
EFAA
5' -GCCAATTGGGACAGACCCTC-3 '
688
15
|
5'-CGCCTTCTGTTCCTTCTTTGGC-3'
|
|
As amostras foram amplificadas num ciclizador térmico de PCR (MJ investigadores INC, EUA), por aquecimento durante 5 min a 95 ° C, seguido de 30 ciclos de 95 ° C durante 60 s , 58 ° C durante 60 s (63 ° C durante
ESP) e 72 ° C durante 60 s, e um passo final de 72 ° C durante 10 min. Os produtos de PCR foram analisados em electroforese em gel de agarose a 0,8% (contendo 0,5% de brometo de etídio em 1 × tampão TBE), que executado durante 50 minutos, por 80 voltagens usando aparelho de electroforese horizontal, e visualizados por sistema de documentação de gel (UVP, EUA). E. faecalis
ATCC 29212 foi usado como um controlo positivo em cada execução PCR para detectar Cyla
, ás
, EFAA
genes, e para testar DNA preparado a partir de certas E. faecalis
cepas (EFS121, EFS87, EFS16, EFS27B, EFSU85 e EFS118) que foram obtidos a partir de Dr. Roberta Creti (Dipartimeno di Malattie Infecttive, Parassitarie ED Immunomediate, Istituto Superiore di Sanità, Viale Regina Elena, 299-00.161 Roma, Itália). Estas preparações de DNA foram usados como um controlo positivo para ESP
gene juntamente com um Kb /marcador 100 bp Ladder (Promega, EUA). A análise estatística
teste de Z foi utilizada para comparar a prevalência de E. faecalis
no grupo de pacientes e grupo controle de acordo com a seguinte equação:
Z = P 1 - P 2 /√P (1-P) (1 /n 1 + 1 /n 2). P & lt; . 0,05
foi considerado estatisticamente significativo
Discussão
O presente estudo mostra que E. faecalis
isolados foram recuperados a partir de pacientes jordanianas em associação com uma ou mais das seguintes doenças dentárias; cáries, gengivite, gengivite induzida por placa, e infecção endodontia, e em uma taxa significativa (7,3%; P = 0,031), em comparação com pessoas saudáveis de controlo (zero). Apesar do fato de que, geralmente, PCR é mais sensível do que o método de cultura na detecção de bactérias em amostras clínicas, este estudo não detectou qualquer E. faecalis positiva
usando amostras de enxaguamento oral directa. Sedgley CM et al., 2005 (19) descobriu que um quantitativo em tempo real PCR relataram uma maior incidência de E. faecalis
em amostras de lavagem oral do que as técnicas de cultura e proporcionou uma maior sensibilidade. O estudo revelou que a má higiene bucal, gengivite e polpas necróticas parecem ser importantes fatores predisponentes para a infecção com E. faecalis
(Tabela 2). Um estudo recente semelhante dos EUA isolou E. faecalis
de 11% das amostras de lavagem oral de pacientes que receberam tratamento endodôntico, mas apenas 1% da E. faecalis
foi recuperado de estudantes de odontologia, sem histórico de tratamento endodôntico [ ,,,0],14]. Os enterococos são capazes de colonizar a cavidade oral, particularmente em pacientes com periodontite ou infecções do canal radicular associados com lesões da mucosa oral e em pacientes imunocomprometidos [20, 21]. Além disso, E. faecalis
é a espécie mais comumente isoladas de amostras de canais radiculares com insucesso endodôntico [2, 21, 22]. E. faecalis
tem sido frequentemente isolado em cultura pura ou como um organismo predominante nos dentes previamente Root- cheias com lesões periapicais ou periodontite apical crônica [3, 19, 23, 24]. Além disso, verificou-se que este organismo infectado persistentemente canal da raiz onde a medicação de hidróxido de cálcio é ineficaz [25].
Este estudo mostra que a produção de hemolisina e gelatinase como determinantes de virulência não foram sempre expressa por E. faecalis
isolados em associação com doenças dentárias, uma vez que apenas 25% de E. faecalis
isolados actividade de gelatinase hemolisina e 37,5%, expresso in vitro, respectivamente. Dois estudos realizados por Sedgley et al
. [14, 23] relataram resultados diferentes com a produção de hemolisina, primeiro estudo demonstrou que 36% das estirpes de E. faecalis
recuperadas a partir de pacientes endodontia hemolisina produzida, enquanto a segunda não detectou produção de hemolisina em qualquer enterococos isolados de endodontia casos. Além disso, Sedgley et al
. [22] verificaram que o gene de gelatinase (gelE) foi detectada em todos os isolados de E. faecalis endodontia de
enquanto expressa actividade de gelatinase foi observada em dois terços dos isolados. Esses estudos concluíram que a evidência de fatores de virulência potenciais foram identificados em endodôntico Enterococcus spp
., Especificamente produção de gelatinase e resposta a feromonas. Outros estudos indicaram que a expressão do gene da gelatinase contribuiu para o aumento da disseminação de E. faecalis
em ambientes de alta densidade, e foi associada com o aumento da adesão de E. faecalis
à dentina in vitro
[26, 27] .
O presente estudo demonstrou que tanto ace Comprar e EFAA
genes estavam presentes em todos os E. faecalis
isolados, enquanto gene Cyla
foi detectada apenas em dois isolados, e todos os isolados foram negativo para esp
gene que é encontrada principalmente em E. faecalis
isoladas de infecções do trato urinário [18].
Um estudo molecular com base em recente indicou que a virulência determinantes EFAA Comprar e ace
genes foi encontrado em todos os E. faecalis
isolados a partir do canal radicular de endodontia pacientes, ao passo que esp
gene estava presente em (58%) e o gene Cyla
na (19,4%) dos isolados [11] . Estes resultados estão de acordo com os nossos resultados, exceto para esp
gene. Em geral, a expressão da atividade da hemolisina e gelatinase ou os seus genes, juntamente com a ocorrência de outros genes de virulência (esp
, Cyla
, ás
, efa A
), em E. faecalis
cepas amplamente variam de um estudo para outro e, provavelmente, devido à diferença em suas origens clínicas e geográficas [5, 9, 11, 26-29]. Além disso, nem ESP nem gelatinase parecia ser necessária para a formação de biofilme; tanto E. faecalis e E. faecium
não mostram uma correlação entre a presença de qualquer esp ou a produção de gelatinase e formação de biofilme [30]. Verifica-se que muitos factores ambientais e genéticos podem estar associados com a produção de biofilme por E. faecalis
[31].
Nos últimos anos, os enterococos ter recebido cada vez mais atenção por causa do desenvolvimento de resistência a múltiplas drogas antimicrobianas e sua prevalência comum em infecções nosocomiais. enterococos resistentes à vancomicina (VRE) provavelmente representam atualmente o mais sério desafio entre muitos micróbios com infecções humanas resistência aos antibióticos causando [32]. Os nossos resultados mostraram que todas as E. faecalis
amostras foram sensíveis ao cloranfenicol, ampicilina, vancomicina, ciprofloxacina, e teicoplanina, mas os isolados eram muito menos sensíveis à eritromicina. Um estudo realizado por Pinheiro et. al
. [12] mostraram que E. faecalis
isolados de amostras orais foram completamente suscetíveis in vitro
à amoxicilina, amoxicilina-clavulânico, vancomicina e em menor grau suscetíveis a eritromicina, a moxifloxacina, cloranfenicol, tetraciclina, doxiciclina e ciprofloxacina . O resultado suscetibilidade de nosso número limitado de E. faecalis
isolados indicaram maior freqüência de taxas de resistência do que os relatados em estudos recentes de países ocidentais [11-13]. Além disso, o nosso resultado susceptibilidade correlacionam-se bem com a alta prevalência de resistência entre clínica e comunidade Staphylococcus aureus
isola na Jordânia [33].
Em conclusão, este estudo mostra que todos os E. faecalis
isolados estão associados com polpas de várias doenças dentárias especialmente necróticas em pacientes e eles levaram tanto a ligação genes de antígenos de proteína e endocardite colágeno.
Declarações
Agradecimentos
Este estudo foi parcialmente financiado pela bolsa da Faculdade de Pós-graduação da Universidade da Jordânia, Amã , Jordan. Os autores agradecem ao Dr. Roberta Creti (Laboratório de Bacteriologia do Instituto de Higiene especial, da Universidade de La Sapienza, Roma, Itália) para o envio de DNA preparado a partir de certas E. faecalis
estirpes que foi usado como controle positivo para esp
gene.
Autores 'arquivos enviados originais para imagens
Abaixo estão os links para os autores' arquivos enviados originais de imagens. 12903_2007_92_MOESM1_ESM.pdf Autores 'arquivo original para a figura 1 Conflito de interesses
Os autores declaram que não têm interesses conflitantes.
Autores' contribuições
AAS e ND-O contribuíram para a concepção de todos os experimentos e escrever o manuscrito . ND-O e OAH examinou todos os pacientes e pessoas de controle e recolheu as amostras orais. RS realizados todos os testes laboratoriais e co-escreveu o manuscrito.
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