Abstract
Fundo
Os papilomavírus humanos (HPV) são oncogênicos e, principalmente, associado a cânceres cervicais. Estudos recentes demonstraram que a infecção por HPV em outros tecidos, incluindo o epitélio da mucosa oral, e. Apesar de um recente estudo piloto forneceu novas informações sobre o estado de HPV oral em adultos saudáveis de Nevada, nenhuma informação foi obtida sobre a prevalência de HPV oral entre as crianças ou adolescentes, portanto, o objetivo deste estudo é fornecer informações mais detalhadas sobre a prevalência oral de alta HPV de risco entre crianças e adolescentes em Nevada
Métodos
Este estudo retrospectivo utilizou amostras de saliva coletadas anteriormente, obtidos de pacientes de consultório dentário pediátricos (com idades entre 2-11). e adolescentes distrito escolar local (com idades entre 12-17) para alta -risco rastreio de HPV (n = 118) utilizando qPCR para a quantificação e a confirmação da sensibilidade analítica e a especificidade.
resultados
um pequeno subconjunto de amostras de saliva foram encontrados para o porto de HPV16 de alto risco (n = 2) e HPV18 ( n = 1), o que representa um 2,5% do total. Todos os três foram obtidos a partir de machos adolescentes, e duas destas três amostras eram de participantes brancos.
Conclusões
Embora este estudo retrospectivo não poderia fornecer correlações com dados comportamentais ou socioeconômicos, este projecto rastreados com sucesso mais de cem amostras de saliva para o HPV de alto risco, confirmando tanto HPV16 e HPV18 estirpes estavam presentes em um pequeno subconjunto. Com a crescente evidência de infecção oral por HPV em crianças, este estudo fornece informações críticas de valor significativo para os outros profissionais de saúde dental, médica, oral e público que procuram promover uma compreensão da saúde bucal e risco de doença em populações pediátricas.
Palavras-chave
Human papillomavirus Saliva triagem material suplementar eletrônico Oral
a versão online deste artigo (doi:. 10 1186 /1472-6831-12-43). contém material suplementar, que está disponível para usuários autorizados
fundo
os papilomavírus humanos (HPV) englobar uma família intimamente relacionada de vírus de ADN, que são capazes de se integrarem no genoma humano para conduzir a transformação do epitélio infectado [1-4]. Grande parte da evidência epidemiológica para carcinogênese orientada por HPV, bem como os mecanismos biológicos, foram derivadas de estudos de cânceres cervicais [5-7] que isolado HPV de alto risco de ambos os carcinomas de células adeno- e escamosas [6-9] . Apesar de HPV de alto risco impulsiona o processo de transformação e malignidade de quase todos os cancros cervicais, a infecção pelo HPV é agora conhecido para modular transformação epitelial na mama, pulmão, peniano, anal, e também tecidos orais [10-20].
O primário fatores de risco para carcinogênese oral são o tabaco e de álcool, apesar de novas linhas de evidência sugerem agora HPV também pode ser um fator de risco independente [17-23]. A maior prevalência de estirpes de HPV de alto risco em tumores de orofaringe pré-cancerosas e cancerosas sugere que o HPV pode preferencialmente infectar desenvolvimento ou estabelecida tipos de câncer, modulando assim a progressão carcinogênica e, finalmente, influenciar os resultados de saúde [24-26]. Na verdade, algumas evidências sugerem que a infecção por HPV de alto risco pode estar associada com uma melhor resposta ao tratamento e taxas de sobrevivência mais elevadas [27-29], enquanto relatos conflitantes demonstraram diminuiu significativamente a sobrevida do paciente [30-32] ou não observei nenhuma discernível e efeitos estatisticamente significativos [33].
Apesar da natureza conflituosa destes resultados, é evidente que o HPV pode estar envolvida na modulação da resposta e progressão do tumor cancerígeno, por conseguinte, muitos destes estudos forneceram informação epidemiológica valiosas sobre o qual alto risco estirpes de HPV são mais frequentemente implicados nestes casos [34-36]. Estes estudos revelaram HPV16, HPV18 e, em menor grau, foram responsáveis pela esmagadora maioria (71-94,7%) de alto risco de HPV oral detectada [17, 18, 21-23, 34-36]. Além disso, novas evidências sugerem agora que essas cepas específicas de HPV de alto risco (HPV16 e HPV18), pode dar início a carcinogênese oral entre a fração menor de pacientes com câncer bucal que não consomem álcool ou uso de tabaco [37, 38].
Based sobre as conclusões de HPV oral em cancros orais não derivados do tabaco e não-álcool associado, outros esforços recentes têm-se centrado mais especificamente para avaliar a prevalência de HPV oral e transmissão dentro de populações saudáveis, que também confirmou que HPV16 e HPV18 foram os mais comumente detectada oral de alta estirpes de HPV -risco [39-41] entre os adultos saudáveis.
Para este fim, um estudo piloto recente avaliação de HPV oral entre adultos saudáveis foi realizada em Nevada [42], um estado recentemente documentado com o aumento das taxas de câncer de orofaringe, em contraste com as taxas de queda observada em estados vizinhos e os EUA de forma mais geral [43, 44]. Este estudo revelou a presença de alto risco estirpe HPV16, mas não HPV18, entre as mulheres e as minorias, os únicos subgrupos populacionais demonstraram ter aumento das taxas de câncer orpharyngeal - apesar das taxas de declínio global observada na população geral [45-47]. Este estudo utilizou um procedimento de triagem com base em saliva, parte de uma tendência crescente para a metodologias menos invasivos, tais como lavage- oral e rastreios à base de saliva, para analisar o status HPV oral em pacientes adultos saudáveis [48-51].
Embora As taxas de prevalência variou amplamente, estes estudos têm sugerido que a infecção oral por HPV pode ser crescente, não só entre os adultos, mas mais especificamente entre os jovens adultos, adolescentes e crianças [52-54] .Para este fim, alguns estudos têm examinado HPV oral em crianças ou adolescentes, embora muitos deles focado principalmente em crianças com condições médicas subjacentes, como a co-infecção com o vírus da imunodeficiência humana (HIV) [55-57]. A maioria outras pesquisas, no entanto, tem-se centrado mais especificamente na elucidação do papel do HPV transmissão vertical, em recém-nascidos, demonstrando o potencial para adquirir HPV de alto risco durante o processo de parto e parto, embora essas infecções normalmente resolver [58-63].
no entanto, novas evidências forem emergentes que demonstraram alto risco de infecção pelo HPV oral em crianças normais e saudáveis, com as maiores taxas observadas entre as crianças com menos de 7 anos de idade (7,9% -8,7%), e queda das taxas observadas entre os adolescentes saudáveis (13- 20 anos de idade; 5,1% -5,2%) e adultos saudáveis (3,5%) [64, 65]. Estas observações podem sugerir que a infecção pelo HPV oral pode ocorrer através do contato pessoal com membros da família ou através do contato com fômites e outros vetores de creches, pré-escola ou em ambientes de ensino fundamental, com a maioria das crianças imunologicamente competentes para resolver estas infecções [66]. No entanto, algumas infecções podem persistir ea sua contribuição para o desenvolvimento de cancros orais e outras patologias ainda não está claro
Embora um estudo piloto foi realizado recentemente para avaliar o estado de HPV oral, isto envolveu pacientes adultos única saudáveis -. Sem informações obtidas sobre bucal A prevalência do HPV entre as crianças ou adolescentes. Com base na evidência prévia demonstrando algum nível de infecção oral por HPV em crianças e adolescentes saudáveis, combinado com a falta de dados sobre esta população mais especificamente, o objetivo deste estudo é fornecer informações mais detalhadas sobre a prevalência de estirpes de HPV de alto risco HPV16 e HPV18 na cavidade oral de crianças e adolescentes em Nevada.
resultados a proporção de espécimes femininos e masculinos a partir da amostra do estudo não foi estatisticamente diferente das proporções globais dentro da comunidade local de Clark County, Nevada ( Tabela 1). Mais especificamente, a percentagem de fêmeas e machos da amostra era aproximadamente igual (51,7% e 48,3%, respectivamente), o que não foi significativamente diferente do que a população de área local (p = 0,7051
). A proporção de minorias amostras (não-branco) foi muito maior na amostra estudada (70,3%) do que na população local (39,1%), que foi estatisticamente significativa (p Art & lt; 0,0001). Embora os dados da população local não estavam disponíveis para comparações específicas por idade, a amostra do estudo foi composta por Mais de crianças mais jovens (idades 2-11: 59,3%) do que de adolescentes e adolescentes (12-17: 40,7%) Tabela 1 análise demográfica. dos participantes do estudo
CCSD (n = 48)
UNLV-SDM (n = 70)
amostra total (n = 118)
Clark County população
análise estatística
Sexo
Feminino
n = 30 (62,5%)
n = 31 (44,3%)
n = 61 (51,7%)
n = 969.781 (49,7%)
χ2 = 0,17849 df = 1
Masculino
n = 18 (37,5%)
n = 39 (55,7%)
n = 57 (48,3% )
n = 981.488 (50,3%)
p
= 0,7051
Corrida
Branco
n = 12 (25%)
n = 23 (32,9%)
n = 35 (29,7%)
n = 1.188.323 (60,9% )
χ2 = 28,3634 df = 1
Non-White
n = 36 (75%)
n = 47 (67,1%)
n = 83 ( 70,3%)
n = 762.946 (39,1%)
p Art & lt; 0,0001
Idade
2-11
n = 0 (0%)
n = 70 (100 %)
n = 70 (59,3%)
N /A
12-17
n = 48 (100 %)
n = 0 (0%)
n = 48 (40,7%)
N /A
detalhada análise de amostras de saliva revelou alguma variabilidade entre as contagens de células, concentração de DNA e pureza do DNA entre as amostras (Figura 1). contagem de células variou entre 0,8 - 2,3 x 10
6 células /mL, que foram ainda classificados em baixo (0,8 - 1,4 x 10 6) e alta (1,6 - 2,3 x 10 6) contagem de células . O DNA foi isolado com sucesso a partir de todas as amostras de saliva, com a concentração média de ADN para amostras observadas em 842,7 ng /mL. Amostras de cada coorte (CCSD, UNLV), com contagens de células na categoria de baixo foram encontrados para ter menores concentrações médias de DNA do que amostras da mesma coorte com contagens de células na alta categoria. As medições de absorvância e análise da razão A260 /A280 confirmou a pureza de ADN isolados, que foi aproximadamente igual entre coortes, bem como entre as amostras no de baixa e alta-categorias de contagem de células. Figura análise 1 Saliva de exemplo: contagem de células, isolamento e pureza DNA. A) A seguir à centrifugação e resuspensão de células em solução salina, o número de células para cada amostra foi determinada revelando três quartos das amostras UNLV foram observados para ter mais baixas contagens de células (0,8-1,4 x 106 células /ml) enquanto apenas um terço da amostra CCSD foram estimados * ter contagens de células mais baixos. B) As concentrações de DNA foram encontrados a ser maior para as amostras com elevado número de células em cada coorte (CCSD: 859,4 e 707,1 ng /ml, respectivamente; unlv: 886,3 e 910,2 ng /mL, respectivamente). A pureza do ADN em média, entre 1,71 e 1,82. C) Igualdade de concentrações de DNA extraído (1 mL) foi rastreada utilizando GAPDH, que não revelou uma variação considerável na intensidade da banda entre coortes de amostras de categorias de alta e baixa contagem de células.
Amostras de DNA extraído foram posteriormente selecionados para o presença de HPV16 e HPV18 usando PCR (Figura 2). Este rastreio resultou em três amostras de HPV-positivo (n = 3/118), que representa 2,5% do total rastreados. Duas dessas amostras (S5, S38) abrigava ADN HPV16 e um foi encontrado para abrigar HPV18 ADN (S7). Processamento de amostras de ADN utilizando qPCR fornecida avaliações quantitativas, bem como as medições de sensibilidade e especificidade. Análise do número de cópias por genoma para o gene doméstico (β-actina) para o HPV-positivo (gama: 25 - 40 cópias /genoma) e as amostras de HPV-negativo (4 - 93 cópias /genoma) revelou valores que estavam bem acima do valor de corte (& gt; 0,1 cópias /genoma). Os resultados da análise qPCR revelou números de cópias de amostras de HPV-positivos (intervalo: 150 - 880 cópias /genoma) que foram significativamente maiores do que as amostras HPV-negativos (intervalo: 0.00148 - 0.0000016 cópias /genoma), o que poderia ser distinguido com o valor de corte (& gt; 0.001 cópias /genoma). Estas análises revelaram sem falsos positivos ou falsos negativos, demonstrando sensibilidade e especificidade suficientes para determinar a proporção de amostras de verdadeiros positivos (HPV-3/118 ou 2,5%; 3/3 ou 100%) e as amostras verdadeiras HPV-negativas (115/118 ou 97,5%; 115/115 ou 100%). Figura 2 Saliva amostra de triagem: análise dos resultados de HPV qPCR. A) três amostras eram portadores do ADN do HPV: As amostras de HPV16-positivo (S5, S38); Uma amostra foi HPV-positivos (S7). B) Análise qPCR revelou amostras HPV-positivos apresentaram valores bem acima do valor de corte estabelecido (& gt; 0.001 cópias /genoma). C) Todas as amostras três HPV-positivos eram do sexo masculino, que representa 2,5% do total (n = 118). Duas das três amostras de HPV-positivos foram de participantes brancos. Todas as amostras de três HPV-positivos eram da coorte CCSD (idades: 12-17); Ambas as amostras de HPV16-positivo foram obtidos a partir de 14 anos de idade participantes, enquanto que a amostra de HPV18-positivo foi obtido a partir de uma de 15 anos de idade.
Embora a proporção relativamente pequena de amostras HPV-positivos não permite mais amplas consequências, uma análise descritiva das informações demográficas sobre estas amostras revelou que todos os três foram obtidos a partir do sexo masculino (n = 3/57 ou 5,3%) e nenhum foi provenientes de fêmeas. As amostras de dois HPV16-positivos foram coletados de participantes brancos com idade entre 14 (n = 2/35 ou 5,7%), enquanto a amostra HPV18-positiva foi recolhida a partir de um participante não-branca com 15 anos (n = 1/83 ou 1,2%) . Todas as amostras três HPV-positivos eram da CCSD coorte (adolescente) (n = 3/48 ou 6,25%), enquanto que nenhuma foi observada no unlv-SDM (pediátrica) coorte (n = 70).
Discussão
o principal objetivo deste estudo foi examinar as crianças e adolescentes saudáveis em Nevada para a presença de alto risco HPV oral. Esta análise retrospectiva usadas amostras de saliva existentes, coletados de pacientes odontológicos pediátricos e adolescentes distrito escolar local, para obter dados novos a partir desta população juvenil nunca antes testado complementando assim o corpo crescente de evidências sobre a prevalência de HPV oral em crianças. Mais importante ainda, estes dados sugerem uma prevalência oral de manchas de HPV de alto risco de, aproximadamente, 2,5%.
Estudos recentes de adultos saudáveis foram encontradas taxas de prevalência semelhantes, variando entre 3,1 e 5% [40, 41]. Na verdade, o recente estudo piloto de adultos saudáveis em Nevada relatou HPV oral em 2,6% dos 151 pacientes livres de câncer [42]. Os resultados do estudo foram significativamente diferentes, no entanto, porque duas das amostras de três HPV-positivos foram obtidos a partir de brancos e todos eram do sexo masculino - ao passo que o estudo prévio dos adultos encontrados HPV oral entre Somente para mulheres e minorias. Outra evidência sugere que, embora as amostras de fêmeas e machos apresentaram taxas semelhantes de HPV oral (56 e 44%, respectivamente), as amostras de HPV-negativos desse estudo foram predominantemente do sexo feminino (82%) - fornecendo alguma evidência de uma possível masculina, fenômeno semelhante aos resultados do estudo em curso [67] específico do género. Embora existam muitas explicações possíveis, tais como a natureza transitória da população local, muitos outros fatores, como estresse, dieta, renda, pobreza, status socioeconômico e exposição ao HPV oral pode afetar diferentes grupos raciais e ambos os sexos de forma semelhante <. br> Este estudo representa um ponto de viragem significativa nos esforços de saúde pública para elucidar a detecção de HPV oral em uma área geográfica conhecida por maior que a média (e, anteriormente, aumentando a) as taxas de câncer de orofaringe [43, 44]. No entanto, este estudo teve várias limitações que devem ser reconhecidos. Em primeiro lugar, a natureza retrospectiva deste estudo limita as inferências que poderiam ser feitas, ao contrário de outros estudos prospectivos recentes de HPV oral em crianças e adolescentes [64-68]. Além disso, há dados comportamentais ou socioeconômicos detalhados estavam disponíveis, tais como renda ou fumar comportamentos parentais, devido à natureza deste estudo piloto retrospectiva. Espera-se que futuras investigações envolvendo HPV oral irá fornecer informações adicionais com informações comportamental mais detalhada, bem como dados sobre habitação, educação, renda e outros indicadores socioeconômicos [67-71].
Conclusões
Este projecto rastreados com sucesso amostras de saliva para HPV de alto risco, confirmando ambas as estirpes HPV16 e HPV18 estavam presentes em um pequeno subconjunto. Embora trabalhos anteriores tem-se centrado sobre a transmissão do HPV oral da mãe para o recém-nascido durante o parto e durante a amamentação [58-63, 68], há cada vez mais evidências que sugerem que após o período perinatal, transmissão de HPV oral através de contato pessoal próximo, como comer compartilhada utensílios, brinquedos, beijos e banhos podem ser responsáveis pela transmissão do HPV oral (principalmente HPV16) em crianças e adolescentes [72-75]. Este estudo, portanto, fornece informações críticas de valor significativo para os outros profissionais de saúde dental, médica, oral e público que procuram promover uma compreensão da prevalência de HPV de alto risco entre as crianças como parte de um entendimento mais amplo da saúde e risco de doença oral em pediatria . populações
Métodos
o tamanho da amostra
Dada a prevalência conhecida de alto risco HPV oral no estudo anterior que rastreados adultos saudáveis dentro desta área geográfica, o tamanho da amostra apropriada foi calculada utilizando a seguinte fórmula: n = Z
2
P
(1 - P
) /d
2, onde n = tamanho da amostra, Z
= Z
estatística para um nível de confiança, P =
prevalência esperada e
d = precisão [76, 77]. Usando o nível de confiança de 95%, o valor de Z
foi determinado ser 1,96; Usando o anterior proporção /prevalência de HPV de alto risco de 2,6%, o valor P
foi definido como P
= 0,026; O valor para d
deve ser calculada em 0.5 (P
), resultando em um valor para d
= 0,013. Usando essas entradas, o tamanho mínimo da amostra para este estudo foi calculada como sendo n = 75.
sujeitos humanos
O protocolo para este estudo intitulado "Avaliação retrospectiva de Microbial Presença no Repositório Saliva existente: A Survey Molecular PCR-Based de Oral populações microbianas de amostras de saliva existentes "foi arquivado, alterado e aprovado pelo Instituto UNLV of Research Integrity - Seres Humanos (OPRs # 1104-3801M) em 10 de maio de 2011. as amostras de saliva existentes foram coletados durante dois estudos anteriores dentro Escola UNLV de Medicina Dentária (SDM), durante 2009-2010. As amostras de saliva coletadas de um estudo prévio de adolescentes (14-15 anos de idade) foram obtidos a partir de uma amostra de conveniência de escolas seleccionadas dentro do Condado de Clark, Distrito Escolar Nevada (CCSD; n = 48); originalmente obtido com a finalidade de examinar níveis de bactérias cariogênicas orais. As amostras de saliva coletadas de crianças (2-11 anos de idade) foram obtidos a partir de uma amostra de conveniência dentro da clínica odontológica pediátrica UNLV-SDM (n = 70); originalmente obtida para efeitos de rastreio de metal pesado (de chumbo ou Pb) fardo. Em resumo, para as coletas de amostras de saliva originais em CCSD e UNLV-SDM, os pais e os indivíduos foram recrutados no local. Os critérios de inclusão: Informado Permissão Consentimento /Parent foi exigidos e realizadas no local, bem como um assentimento a participar de uma pesquisa para todas as crianças com mais de sete anos de idade que eram capazes de ler. Os critérios de exclusão: indivíduos com menos de sete anos de idade, sujeitos que se recusaram a participar, e em indivíduos com pais que se recusaram a participar. Cada amostra foi atribuído um número único, gerado aleatoriamente para evitar viés de pesquisa, com a única informação demográfica sobre as amostras de saliva: sexo, idade e etnia dos participantes estudo original. Este projeto atual foi uma análise retrospectiva destes dois conjuntos de amostras de saliva; o tamanho da amostra total combinado para este estudo foi n = 118.
Saliva coleção protocolo Online em breve, os sujeitos que concordaram em participar foi dada uma pequena, estéril recipiente de recolha de saliva, 50 mL tubo de polipropileno estéril (Fisher Scientific: Fair Lawn, New Jersey, EUA). Os participantes foram, então, pediu para mastigar um pequeno pedaço de cera de parafina durante um minuto e, em seguida, para expectorar, de acordo com o protocolo do estudo piloto anterior [42]; os volumes de amostra variou de cerca de 50 uL a 2,5 mL. As amostras foram armazenadas em gelo até que o transporte para um laboratório para análise biomédica. Cada amostra de saliva foi atribuído um número único, gerado aleatoriamente para evitar viés de pesquisa. A informação demográfica sobre a amostra foi recolhida ao mesmo tempo, que consistia de apenas a idade, sexo e a etnia.
contagem celular e o isolamento do DNA
Todas as amostras foram centrifugadas durante 10 minutos a 2100 g (RCF) e o sedimento de células lavado com 1X solução salina tamponada com fosfato (PBS) (Hyclone: Logan, Utah, EUA) e ressuspensas em 5 mL de 1X PBS. O número de células foi determinada utilizando azul de tripano (Fisher Scientific: Fair Lawn, New Jersey, EUA), utilizando um microscópio invertido Zeiss Axiovert 40 (Carl Ziess, Inc: Thornwood, Nova Iorque, EUA) e um hemacitómetro (Fisher Scientific: Fair Lawn, Nova Jersey, EUA). Para determinar se quaisquer amostras abrigava o vírus HPV, ADN foi isolado a partir da amostra de saliva através de um mínimo de 3,5 x 10 5 células utilizando o kit de isolamento de ADN GenomicPrep (Amersham Biosciences: Buckinghamshire, Reino Unido), utilizando o procedimento recomendado pelo o fabricante, como previamente descrito [12, 42, 78, 79]. A pureza do ADN foi calculada utilizando medidas da razão de absorvância a 260 e 280 nm (razão A260 /A280 entre 1,7 e 2,0).
reacção em cadeia da polimerase (PCR)
DNA de cada amostra foi então utilizada para realizar PCR com o Fisher exACTGene kit PCR completo (Fisher Scientific: Fair Lawn, New Jersey, EUA) e um gradiente termociclador Mastercycler (Eppendorf: Hamburgo, Alemanha), utilizando os seguintes iniciadores para HPV16 [12, 78], HPV18 [12, 78, 79], e glyceraldehyde- 3- fosfato desidrogenase (GAPDH) [80] (SeqWright: Houston, Texas, EUA):.
HPV16 iniciador directo, ATGTTTCAGGACCCACAGGA;
HPV16 iniciador inverso, CCTCACGTCGCAGTAACTGT
HPV18 iniciador directo, ATGGCGCGCTTTGAGGATCC;
iniciador de HPV18, GCATGCGGTATACTGTCTCT reversa;
GAPDH iniciador directo, ATCTTCCAGGAGCGAGATCC;
GAPDH iniciador inverso, ACCACTGACACGTTGGCAGT;
Um ug de ADN molde foi utilizado para cada reacção. O passo inicial de desnaturação decorreu durante três minutos a 94 ° C. Um total de 30 ciclos de amplificação foram corridos, que consiste de 30 segundo desnaturação a 94 ° C, 60 segundos de emparelhamento a 58 ° C e 30 segundos de extensão a 72 ° C. extensão final foi executada durante cinco minutos a 72 ° C. Os produtos da reacção de PCR foram separados por electroforese em gel usando 4% Reliant NuSieve® 3: 1 géis Além disso agarose (Lonza: Rockland, Maine, EUA). As bandas foram visualizadas pela iluminação UV de etídio-coradas com brometo de géis e capturou usando um sistema de e 1D de imagem 100 Software Kodak Gel Logic Análise de Imagem (Eastman Kodak: Rochester, Nova York, EUA)
PCR quantitativo (qPCR) amostras de DNA foram então processados usando qPCR para fornecer quantificação mais específico e sensível. Iniciadores e sondas foram concebidos utilizando o software biblioteca Roche Universal Sonda (UPL) de criação de ensaio para amplificar a região de sobreposição de E6 e E7 de sequência do gene de HPV16 (de acesso do GenBank. Genbank K02718) e o gene de manutenção β-actina humano (GenBank n. M10277) . Estes iniciadores foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, EUA) e as sondas a partir de Roche Applied Science (Indianapolis, Indiana, EUA).
HPV16 E6 /E7 iniciador directo 5'-CAACTGATCTCTACTGTTATGAGCAA-3 ', HPV16 E6 /E7 iniciador inverso 5'-CCAGCTGGACCATCTATTTCA-3 ', HPV16 E6 /E7 de hidrólise "Taqman" sonda 5' - (fAM) -AGGAGGAG- (escuro corante extintor) -3 '(UPL sonda # 63) foi usada para amplificar o 73 pares de bases (pb) a região entre a posição 535 nucelotide (nt) e 607 posição nt. HPV18 E7 iniciador directo 5'-GACTCAGAGGAAGGAAAACGATGAAA, HPV18 E7 iniciador inverso 5'-GTGACGTTGTGGTTCGGCT; HPV18 E7 sonda 5'-TGGAGTTAATCATCAACATTTACCA foi utilizada para amplificar a região de 25 pb entre a posição 715 e 739 nt. Humana β-actina iniciador directo 5'-GTGGGGTCCTGTGGTGTG-3 ', humanos β-actina 5'-GAAGGGGACAGGCAGTGA-3', hidrólise β-actina "Taqman" Human sonda 5 '- (FAM) -GGGAGCTG- (escuro quencher corante) - 3 '(UPL sonda # 24) amplificaram a região de 61 pb entre os nt 2642 e 2702 posição posição nt.
o tempo real mistura reaccional foi preparado de uma placa com múltiplas cavidades 480 LightCycler® 96 contendo 1x LightCycler® 480 Sondas mestre (Roche Ciências Aplicadas: Indianapolis, Indiana, EUA), de 1 um de cada respectivo conjunto de primers (frente e verso), 0,2 m de respectiva sonda e 2 ul de modelo de DNA; num volume de reacção final de 20 ul. A mistura de sondas mestre continha tampão de reacção, mistura dNTP (incluindo dUTP em lugar de dTTP), MgCl mM 3,2 2, e Taq DNA polimerase
. O ensaio de PCR em tempo real foi realizada em um sistema LightCycler 480 (Roche Applied Sciences: Indianapolis, Indiana, EUA) com os seguintes parâmetros do ciclo: pré-incubação durante a activação inicial da enzima a 95 ° C durante 10 minutos, seguido por 45 ciclos de 95 ° C durante 10 segundos (velocidade de rampa de 4,4 ° C /segundo), 60 ° C durante 30 segundos (velocidade de rampa de 2,2 ° C /segundo) e 72 ° C durante 1 segundo (velocidade de rampa de 4,4 ° C /segundo). A seguir fase de amplificação, um passo de arrefecimento foi realizada a 40 ° C durante 30 segundos (velocidade de rampa de 2,2 ° C /segundo). Aquisição do sinal de fluorescência foi realizada utilizando a configuração (465-510 nm) a seguir a 72 ° C fase de extensão de cada ciclo de Mono hidrólise da sonda. Todas as amostras foram realizadas em triplicado
O CaSki (American Type Culture Collection; Manassas, Virgínia, EUA). A linha celular de adenocarcinoma cervical foi usado para desenvolver curvas padrão, tanto para o HPV16 (600 cópias /genoma) e GAPDH (2 cópias /genoma) genes. O GH354 (American Type Culture Collection; Manassas, Virgínia, EUA) linha celular de adenocarcinoma cervical foi usado para desenvolver as curvas padrão para HPV18 (200 cópias /genoma). DNA extraído a partir de células CaSki e GH354 foram diluídas em série de dez vezes a partir de 50 ng a 0,0005 ng [81] A quantificação foi conseguida utilizando Ciclo Limiar (C T) medido com o segundo método de máxima derivado (LightCycler 480 Software versão 1.5.0.39; Roche Applied Sciences: Indianapolis, Indiana, EUA). Saliva amostras & gt; 0,001 copy /genoma foram considerados HPV positivo. Especificidade análise foi realizada no ensaio qPCR contra HPV 18 e verificou-se ser de 100% de especificidade (resultados não apresentados)
A avaliação estatística
A sensibilidade e especificidade foram calculados como a proporção de verdadeiros positivos e verdadeiros negativos (valor de corte & gt;. 0,001 cópias /genoma), respectivamente. Após a aquisição de amostras de saliva e resultados de rastreio de HPV, informações demográficas das amostras foram comparadas com o perfil demográfico geral da população local, utilizando o teste do qui-quadrado (χ2), para determinar se qualquer característica (sexo, raça, idade) foi diferente do que o esperado entre os sujeitos avaliados neste estudo (n = 118). Um nível de probabilidade de alfa (α) = 0,05 foi utilizado para determinar a significância estatística
abreviações
HPV:.
Papilomavírus humano
DNA:
O ácido desoxirribonucléico
EUA:
Estados Unidos
PCR:
reação em cadeia da polimerase
OPRs:
Gabinete para a Protecção de Pesquisa Humana Assuntos
CCSD:
Clark County Nevada - Distrito Escolar
< dfn> UNLV-SDM:
Universidade de Nevada Las Vegas - Faculdade de Medicina Dentária
RCF:
força centrífuga relativa
PBS:
fosfato-solução salina tamponada
GAPDH:
gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase
qPCR:
reação em cadeia da polimerase quantitativa
bp:
par base de
nt:
Nucleotide
dNTP:
desoxirribonucleótido trifosfato
dUTP: Página 2-desoxiuridina trifosfato
dTTP:
desoxitimidina trifosfato .
Declarações
Agradecimentos
os autores gostariam de agradecer a Escola UNLV de Ciências comunitários de Saúde e Departamento de Ciências Biomédicas UNLV-SDM, Instituto de Investigação e do Programa de Educação avançada em Pediatric Odontologia para fornecer os insumos e reagentes para este estudo piloto inicial.
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Os autores declaram que não têm interesses conflitantes. contribuições
dos autores
KK e CF concebidas, acompanhados, e coordenou o projeto experimental. KH, EE, JA e AH foram responsáveis por assuntos de recrutamento, consentimento informado, a recolha de amostras, e alguma análise biomédica. CF, EE, JA, e AH realizada a extração de DNA, análise de PCR e qPCR. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.
