da arte abstracta
Fundo
Um elemento-chave para o sucesso a longo prazo de implantes dentários é a integração da superfície do implante com os tecidos hospedeiros circundantes. Modificação de superfícies de implantes de titânio pode melhorar a atividade dos osteoblastos, mas os seus efeitos sobre as células dos tecidos moles não são claras. A adesão de queratinócitos humanos e de fibroblastos gengivais para controlar de titânio comercialmente puro (CpTi) e duas superfícies preparadas por oxidação anódica, por conseguinte, foi investigada. Desde pilares de implantes estão expostos a um ambiente rico em bactérias in vivo
, também foi avaliado o efeito de bactérias orais sobre a adesão dos queratinócitos.
Métodos
As superfícies foram caracterizadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV). O número de células aderidas e força de ligação, bem como a vitalidade de fibroblastos e queratinócitos foram avaliados por microscopia de laser confocal de varrimento, após coloração com Bac inoperante
luz Live /. Para avaliar o efeito de bactérias sobre a adesão e vitalidade, queratinócitos foram co-cultivados com um quatro-espécies consórcio estreptocócica.
Resultados da análise SEM mostrou as duas superfícies oxidado anodicamente estar com diferentes graus de pore- nano-estruturados densidade. Ao longo de 24 horas, ambos os fibroblastos e queratinócitos aderiu bem às superfícies nanoestruturados, embora a um grau menor do que para CpTi (intervalo de 42-89% dos níveis de CpTi). A força de adesão de queratinócitos foi maior do que a dos fibroblastos, mas não há diferenças na força de adesão pode ser observada entre as duas superfícies nanoestruturados ea CpTi. O consórcio de estreptococos commensal reduziu acentuadamente a adesão dos queratinócitos em todas as superfícies, bem como comprometer a integridade da membrana das células aderidas.
Conclusão
Tanto a vitalidade e nível de aderência de células do tecido mole às superfícies nano-estruturadas foi semelhante ao da CpTi. A co-cultura com estreptococos reduziu o número de queratinócitos em todas as superfícies para aproximadamente o mesmo nível e causou dano celular, sugerindo que as bactérias comensais poderia afectar a adesão de células de tecidos moles ao pilar superfícies in vivo
. Palavras-chave
queratinócitos orais gengival fibroblastos anexo celular implante dental modificação da superfície bactérias orais material suplementar Electrónicas | A versão online deste artigo (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-75) contém material suplementar, que está disponível para usuários autorizados. Background
Devido às suas geralmente bons resultados clínicos, os implantes dentários são agora um tratamento comum para a substituição de dentes perdidos ou ausentes. Os elementos chave para o sucesso a longo prazo de tais implantes são a formação de uma ligação estável entre o tecido ósseo e a superfície do hospedeiro fixação (integração óssea) e a integração do componente transmucosa, ou de encosto, com os tecidos moles. Anteriormente, muita investigação tem-se concentrado sobre a optimização da osseointegração mas, mais recentemente, o foco mudou para incluir o desenvolvimento de biomateriais que melhoram a formação de uma barreira de tecido mole peri-implante. Na cavidade oral, pilares de implantes salientes através da mucosa está exposta a um ambiente contendo complexo saliva e exsudato gengival, assim como microorganismos. A carga microbiana da cavidade oral é muito alta, e até 700 espécies diferentes foram identificados [1]. Após a colocação, a superfície de encosto fica rapidamente colonizado por bactérias orais que podem competir com as células dos tecidos epiteliais e conjuntivos para a ligação à superfície (para uma revisão ver [2]). Exemplos típicos dos colonizadores iniciais em ambos os tecidos duros e moles da cavidade oral são streptococci, incluindo Streptococcus gordonii
, Streptococcus oralis
, Streptococcus mitis e Streptococcus sanguinis
, bem como espécies, tais como Actinomyces naeslundii
[3, 4]. A adesão destes microorganismos à superfície de encosto podem proporcionar locais de ligação para um novo conjunto de colonizadores, eventualmente, conduzindo à formação de placa madura [5, 6]. Online em dentes naturais invasão bacteriana nas periodontais tecidos moles é limitada fisicamente pela mucosa gengival, que forma uma vedação em torno do colo do dente. O epitélio também actua como uma barreira fisiológica através da libertação de moléculas envolvidas na imunidade inata, incluindo péptidos antimicrobianos e citocinas, bem como a iniciação de respostas inflamatórias [7]. No caso de implantes dentários a barreira natural que consiste em epitélio de junção e do ligamento periodontal é inexistente, aumentando, assim, a importância de uma manga de tecido mole de células epiteliais e fibroblastos firmemente ligado ao pilar. Estudos em cães sugeriram a mucosa peri-implante pode formar uma vedação através de uma braçadeira da mucosa bem-queratinizado, análogo ao dentes naturais circundantes [8] e as camadas de células epiteliais foram identificados em estreita associação com superfícies de titânio implantadas no bucal mucosa [9]. Além disso, estudos histológicos indicam que as células epiteliais pode anexar a superfícies de titânio por meio de hemi-desmossomas semelhantes aos encontrados na lâmina basal interna [10]. O arranjo de tecidos moles na interface da mucosa foi mostrado para ser influenciada pela modificação da topografia da superfície do implante de titânio com oxidação ou ataque ácido, bem como a modificação química com laminina 5 [11, 12]. Recentemente, o papel de nanoestruturas em superfícies de implantes de titânio na cicatrização de tecidos tornou-se um dos principais focos de interesse. Nanoestruturas, incluindo nanoporos e nanotubues, pode ser criado por oxidação anódica, um método electroquímico no qual as variáveis tais como a tensão, concentrações e tempo de electrólitos podem ser variadas para criar diferentes nanotopographies. No entanto, enquanto que os efeitos das modificações sobre o nível de actividade dos osteoblastos em nanometros têm sido extensivamente estudados [13, 14], o conhecimento de como nanoestruturas influenciar peri-implante cicatrização de tecido mole é actualmente limitada. Os poucos in vivo
estudos que têm sido realizados em ratos [15], cães [16] ou de seres humanos [17] (Wennerberg et al.
) Sugerem que o uso de superfícies de encosto nanoestruturado de titânio pode melhorar de tecidos moles cura. Uma in vitro
estudo realizado por Zile et al
. [18] revelou que a densidade de queratinócitos sobre superfícies nanotubular e nanorough foi aumentado em comparação com que sobre superfícies de titânio convencionais enquanto que para fibroblastos, tais estudos têm mostrado o aumento da adesão de células em superfícies nanoestruturados preparados por oxidação anódica [19], mas diminuiu a adesão aos revestimentos de titânio nano-estruturados em silicone [20]. Embora estes estudos in vitro têm
lançar luz sobre possíveis efeitos positivos das referidas superfícies, in vivo
, a situação durante as fases iniciais da cura é muito mais complexa, em que a fixação das células ocorre na presença de bactérias orais colonizadores iniciais tais como estreptococos orais. Portanto, neste estudo, investigamos a adesão dos queratinócitos humanos e fibroblastos gengivais de superfícies de titânio nano-estruturados e também avaliou o efeito de um consórcio bacteriano contendo Streptococcus gordonii
, oralis Streptococcus
, Streptococcus mitis Comprar e Streptococcus sanguinis
na adesão de queratinócitos às superfícies.
Métodos
titânio superfícies
discos de titânio (8 mm de diâmetro e 2 mm de espessura) com três superfícies diferentes foram utilizados neste estudo. discos de titânio comercialmente puro (CpTi) foram utilizados como controlos (C) e duas superfícies anodicamente oxidada (-N1 e N2) foram utilizados como superfícies de ensaio. N1 foi preparado por oxidação anódica de titânio comercialmente puro Considerando N2, foi preparado por oxidação anódica em liga de titânio (TiAl
6V 4). Auger análise por espectroscopia de elétrons revelou a camada de óxido sobre as superfícies N1 e N2 a ser superior a 100 nm de contacto ângulos de espessura ea média para o controle, N1 e N2 superfícies não apresentaram diferenças significativas (51 ° ± 2, 42 ° ± 1 ° , 38 ° ± 0,3 °, respectivamente) [21]. as medições de perfilometria da rugosidade média (Sa) mostrou que todas as superfícies tinham uma topografia lisa com Sa de 0,18 mm para a superfície de controle, e 0,17 uM e 0,21 uM, respectivamente, para o N1 e N2 superfícies [21]. Antes da utilização, os discos de titânio foram limpas por tratamento com ultrassons em etanol a 70% PRO-analys durante 2 × 10 minutos, seguido por lavagem com água ultrapura esterilizada durante mais 2 × 10 minutos. Microscopia electrónica de digitalização
A morfologia da superfície dos discos de titânio foi examinada usando um microscópio electrónico de Ultra 55 de varrimento Zeiss. As imagens foram tiradas com um detector de electrões secundário a 8000 × ampliação usando uma tensão de aceleração de 10 kV e uma abertura lente objetiva de 30 mm.
Fibroblastos gengivais humanos
cultura de fibroblastos gengivais humanos foram estabelecidas a partir de biópsias gengivais obtidos a partir de dois indivíduos saudáveis (com idade entre 11-13 anos) sem sinais clínicos de doença periodontal. O sueco Central Ethical Review Board, Estocolmo aprovou a coleta de biópsias eo estabelecimento das linhas de células de fibroblastos (registro número 377/98). pedaços triturados de tecido gengival foram explantadas de 25 cm 2 frascos de cultura de tecidos (Falcon) contendo 5 ml de DMEM suplementado com penicilina (50 unidades /ml), estreptomicina (50 ug /ml) e 5% de soro fetal de vitelo (FCS ) (Invitrogen Life Technologies, Escócia, Reino Unido). fibroblastos gengivais obtidos por tripsinização da excrescência de células primárias foram cultivadas a 37 ° C com 5% de CO 2 e rotineiramente passadas utilizando tripsina a 0,025% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo EDTA a 0,02% a 90% de confluência. fibroblastos gengivais humanos entre os dias 9 e 14 passagens foram utilizados neste estudo.
queratinócitos orais humanos
Imortalizada queratinócitos orais humanas normais (OKF6 /TERT-2) [22] obtidas a partir de Dr James Rheinwald (Hospital Brigham and Women, Boston, EUA), foram semeadas em placas de cultura em meio de queratinócito isento de soro (Gibco) suplementado com 0,2 ng ml -1 factor de crescimento epidérmico humano recombinante, 25 ug de extracto de pituitária bovina ml -1 e 0,3 mM de CaCl 2 contendo 1 UI ml de penicilina -1 e 1 ug ml de estreptomicina -1 (forma DF-K) e cultivadas em 5% de CO 2 no ar a 37 ° C. O meio foi mudado após 1 dia e a cada 2-3 dias seguintes, até as células atingiram 30-50% de confluência. As células foram passadas utilizando 0,05% de tripsina-EDTA (Gibco).
De ensaio de adesão celular
discos de titânio foram colocadas em pratos de 24 poços de cultura de tecido (Becton Dickinson), quer queratinócitos semeadas com fibroblastos gengivais ou (1 × 10 < sup> 5 células em um mL de meio DF-K ou DMEM suplementado com penicilina (50 unidades /ml), estreptomicina (50 ug /ml) e 5% de soro fetal de vitela, respectivamente) e incubadas em 5% de CO 2 em ar a 37 ° C durante 24 horas. Este ponto de tempo foi escolhida uma vez que um número suficiente de células tinha aderido, a fim de que os resultados sejam divisão celular mas pouco fiável tinha ocorrido. Os discos foram delicadamente lavadas com PBS para remover células não ligadas e coradas usando o Live /Dead Bac
kit de coloração Light (Molecular Probes). As células aderentes foram visualizadas utilizando um microscópio de fluorescência. Para avaliar como as células foram presas ao substrato, um procedimento de lavagem normalizado foi usado para remover as células fracamente aderentes [23]. Os discos em placas de cultura contendo 1 mL de PBS foram agitadas a 100 rpm durante 2 × 5 minutos (IKA Vibrax agitador rotativo, GMBH & amp; Co., Alemanha). Células remanescentes após este procedimento foram contadas manualmente após coloração com o Live /Dead Bac
kit de coloração clara e captura de imagem usando microscopia de fluorescência. O número de células remanescentes depois da lavagem foi expressa como uma razão de controlo (número de células presentes antes da lavagem). As estirpes bacterianas
isolados clínicos de S. Gordonii
(HC7), S. mitis
(BA7), S. oralis
(89C) e S. sanguinis
(FC2) foram utilizados neste estudo. S. Gordonii
, S. mitis
e S. sanguinis
foram obtidos a partir da placa dentária proximal, enquanto S. oralis
foi isolado a partir de uma infecção peri-implante. S. Gordonii
foi identificado por testes fenotípicos positivo para a N-acetil-glucosaminidase
, N
-acetylgalactosaminidase, α-fucosidase e β-galactosidase enquanto a identificação de S. mitis
foi baseado em fenotípica positiva testes para N-acetil-
galactosaminidase, N-acetil-
glicosaminidase, β-galactosidase e sialidase.
Identificação de S. sanguinis
foi baseada em testes fenotípicos negativas para sialidase, arbinosidase, L- fucosidase, α-glicosidase e firme adesão MSA agar e S. oralis
foi identificado através de testes fenotípicos positivos para N
-acetylglucosaminidase e sialidase e um teste negativo para D-fucosidase, além de sequenciação do gdh
e genes ddl [24]. As bactérias foram cultivadas em agar de sangue numa atmosfera de 5% de CO 2 no ar a 37 ° C. As colónias foram transferidas para Bacto caldo Todd-Hewitt (TH) (Becton Dickinson & amp; Co) e crescidas durante a noite em 5% de CO 2 no ar a 37 ° C. As suspensões foram transferidas para caldo TH fresco e incubadas a 37 ° C, até a fase de crescimento meio-exponencial foi alcançado (A 600 ≈ 0,5), correspondente a 10 7 células /ml. Log culturas de fase de cada estirpe foram então misturados (1: 1: 1: 1) para dar um consórcio de quatro espécies e centrifugado (4000 g
) durante 10 min. Os peletes foram então re-suspensas em meio de queratinócito isento de soro (Gibco) suplementado com 0,2 ng ml -1 factor de crescimento epidérmico humano recombinante, 25 ug de extracto de pituitária bovina ml -1 e 0,3 mM de CaCl 2 para dar uma concentração final de 10 7 células /ml.
efeito de bactérias orais na adesão de queratinócitos
para estudar o efeito de bactérias orais na adesão de queratinócitos, discos de titânio foram inoculadas com 1 ml de OKF6 /tert 2 células e estas foram deixadas a aderir durante 16 horas. Após este tempo, 1 ml do consórcio bacteriana quatro espécies contendo 10 7 células em meio de queratinócito isento de soro, tal como descrito acima, foi adicionado e os discos, em seguida, incubadas em 5% de CO 2 no ar a 37 ° C durante um adicional de 8 horas. Depois de um tempo total de incubação de 24 horas, os discos foram lavados suavemente com meio de queratinócito isento de soro, para remover células não ligadas e as células aderentes restantes manchadas com o Live /Dead Bac
kit de coloração de luz (Molecular Probes) antes da visualização num microscópio de fluorescência. Para avaliar a resistência de ligação das células de bactérias tratada para o substrato, foi utilizado o mesmo procedimento de lavagem normalizado, conforme descrito acima. Alternativamente, os discos de titânio foram inoculadas com 1 ml do consórcio bacteriana quatro espécies contendo 10 7 células em meio de queratinócito isento de soro (5% de CO 2 no ar a 37 ° C) durante 2 horas e lavou-se três vezes com meio queratinócito isento de soro antes da adição de 1 × 10 5 células em 1 ml de meio de queratinócito isento de soro durante 22 horas. a análise de imagem
e estatísticas
experimentos foram realizados três vezes usando celular independente e culturas microbianas. Para todos os experimentos, as imagens foram tiradas nos mesmos vinte pontos padronizadas sobre as superfícies, evitando o centro e as bordas extremas dos discos. Os resultados para as superfícies de teste foram comparados para controlar usando ANOVA, com um pós-teste de Bonferroni e p-valores inferiores a 0,05 foram considerados significativos.
Resultados da morfologia da superfície
A superfície micrografias do controle CpTi e superfícies anodicamente-oxidados, são mostrados na Figura 1. a superfície do disco de controlo CpTi tinham uma topografia anisotrópica semelhante ao de implantes maquinados comerciais. Ambas as superfícies de anodicamente oxidada (-N1 e N2) tinha poros na gama de 50 nm. Na superfície N1, a poro densidade era elevado e os poros estavam uniformemente distribuídos sobre a superfície enquanto que nas superfícies de N2, os poros mais esparsamente distribuídos e agrupados, dando origem a zonas livres de poros maiores. Figura 1 imagens SEM de CpTi e superfícies anodicamente oxidados. Imagens representativas de controlo (CpTi) (C), e superfícies anodicamente oxidada (N1 e N2). A barra de escala representa 1 mm.
Penhora de fibroblastos gengivais humanos para superfícies de titânio nano-estruturados
adesão de fibroblastos gengivais humanos para as três superfícies, controle CpTi, N1 e N2 foi investigada. As células foram deixadas aderir durante 24 horas, antes da coloração com Bac
luz vivo /morto e visualização de um microscópio de fluorescência. A análise da imagem mostrou que as células têm uma morfologia característica alongada de fibroblastos (Figura 2a). Na superfície de controlo do CpTi, a densidade celular foi relativamente elevada (Figura 2a), o que corresponde a cerca de 781 ± 87 células mm -2 (Figura 2b). Níveis de cobertura para a superfície de N2 foram (669 ± 26 células mm -2), correspondendo a 85% do controlo, enquanto que a cobertura sobre a superfície da N1 (328 ± 84 células mm -2) correspondeu a 42% de controlo (Figura 2a, b). A redução na superfície da N1 foi significativo ao nível de 5% em relação ao controle. Assim, os fibroblastos gengivais mostraram uma capacidade um pouco inferior para aderir à N1 do que para o controlo e superfícies N2. Figura 2 A adesão de fibroblastos gengivais humanos para o controle CpTi (C) e (N1 e N2) superfícies nano-estruturadas. (A) células aderidas foram coradas com o Live /Dead Bac
Luz e visualizadas em um microscópio de fluorescência. A barra de escala representa 50 um. (B) Os gráficos mostrando o número médio de células aderentes ± SEM de três experiências independentes. Os dados foram analisados utilizando ANOVA com um pós-teste de Bonferroni (* p & lt; 0,05).
Um ensaio, com base no número de células foram removidos por um procedimento de lavagem normalizado, foi utilizada para determinar a força de adesão dos fibroblastos sobre o três superfícies. O número de células aderentes remanescentes após o tratamento foi quantificada e calculada como uma percentagem do número de células inicial sobre a mesma superfície. Este revelou que o controlo sobre a superfície de CpTi, 33 ± 0,7% das células após a lavagem manteve-se enquanto que para as superfícies N1 e N2, os valores correspondentes foram de 44 ± 6.8% e 23 ± 2.7%, respectivamente. Estes dados indicam que não houve diferença entre a força de adesão dos fibroblastos gengivais para o controlo de CpTi e as superfícies nanoestruturados.
Aderência de keratinocyes orais para superfícies de titânio
As outras células de tecidos moles de importância para integração dos implantes dentários são queratinócitos orais, e, por conseguinte, a aderência destas células para as três superfícies também foi testada. Após 24 horas, os queratinócitos foram viáveis e foram encontrados como aglomerados de células com uma morfologia típica poligonal, distribuídos uniformemente sobre a superfície dos discos de titânio (Figura 3A). Na superfície de controle do CpTi, o número médio de células era de 470 ± 73 milímetros -2. O número médio de células na superfície do N1 (419 ± 107 milímetros -2) foi semelhante à da CpTi Considerando que na superfície de N2 foi um pouco inferior (284 ± 27 mm -2). Estes valores correspondem a 89% e 60%, respectivamente, do nível da superfície do controlo. Nenhuma destas diferenças foi significativa no nível de 5% (Figura 3b). A força de adesão dos queratinócitos sobre as superfícies foi investigada utilizando o ensaio de lavagem. Proporções semelhantes das células ligadas manteve-se em todas as três superfícies após a lavagem, o que sugere que a força de adesão dos queratinócitos não foi influenciado pela presença de nano-estruturas (coluna da esquerda, Tabela 1). Figura 3 A adesão dos queratinócitos orais humanos para o controle CpTi (C) e (N1 e N2) superfícies nano-estruturadas. (A) células aderidas foram coradas com o Live /Dead Bac
Luz e visualizadas em um microscópio de fluorescência. A barra de escala representa 50 um. (B) Os gráficos mostrando o número médio de células aderentes ± SEM de três experiências independentes
Tabela 1 em Queratinócitos de CpTi (C) e superfícies nanoestruturados (N1 & amp; N2). Após uma lavagem normalizado, expresso como uma percentagem do níveis pré-lavagem para a mesma superfície
queratinócitos restante em superfícies após lavagem
superfície
- bactérias
+ bactérias
C
83 ± 5,5%
96 ± 0,3%
N1
75 ± 1,4%
83 ± 3,5%
N2
94 ± 1,5%
87 ± 4,6%
Influência da estreptococos orais sobre a ligação dos queratinócitos
na área onde o pilar emerge através do epitélio oral, os queratinócitos fixação à superfície de encosto estão expostos a microbiota oral. Por conseguinte, a influência de um consórcio de colonizadores iniciais sobre a adesão de queratinócitos foi investigada. A presença de bactérias durante os últimos 8 horas de período de adesão causado uma redução acentuada no número de queratinócitos encontrados em todas as superfícies em relação ao nível observado na ausência de bactérias (Figura 3B), embora esta diferença não foi significativa no 5% de nível (Figura 4a, b). Um pequeno número de bactérias foram encontrados como aglomerados associados tanto com a superfície de titânio e os ceratinócitos aderentes. Estes dados sugerem, assim, que a presença de bactérias, quer reduzida a capacidade dos queratinócitos para se ligar às superfícies ou descolamento causado de células aderidas. Curiosamente, o núcleo dos queratinócitos expostas às bactérias para 8 horas mostraram coloração com vermelho ou laranja com o Bac
luz vivo inoperante mancha /que não foi observado nos queratinócitos não expostos (Figura 5). Isto indica que o iodeto de propídio tinha entrado nas células e é indicativo de danos para a membrana celular. A presença das bactérias, assim, não só pareceu causar uma redução no número de células aderentes líquida ao substrato depois de 24 horas, mas também afectou a viabilidade celular. Para investigar o efeito de bactérias na força de adesão de queratinócitos, o ensaio de lavagem também foi aplicado a células anteriormente expostos às bactérias. Após este tratamento, não houve diminuição significativa no número de células presentes na superfície em comparação com os níveis pré-lavagem foi observado para qualquer uma das superfícies (coluna da direita, Tabela 1). Estes resultados sugerem, portanto, as bactérias não afecta a força de adesão dos queratinócitos para as diferentes superfícies. A adesão dos queratinócitos a superfícies já colonizados pelo consórcio de estreptococos orais também foi investigado. Após 2 horas, a cobertura de superfície pelo consórcio foi de cerca de 50% e de 20 horas após a adição, a adesão única esporádica de queratinócitos foi observada (dados não mostrados). Assim, a presença de bactérias colonizadoras iniciais sobre as superfícies de titânio claramente inibida a subsequente ligação de queratinócitos. Figura 4 A adesão dos queratinócitos orais humanos para o controle CpTi (C) e (N1 e N2) nano-estruturados superfícies incubadas com um consórcio de estreptococos orais. (A) células aderidas foram coradas com o Live /Dead Bac
Luz e visualizadas em um microscópio de fluorescência. A barra de escala representa 50 um. (B) Os gráficos que mostram o número médio de células aderidas ± SEM de três experiências independentes.
Figura 5 Efeitos de um consórcio de estreptococos orais sobre os queratinócitos. queratinócitos oral humana foram cultivadas em superfícies de controlo (C), na ausência (painel da esquerda) ou na presença (painel da direita) de um consórcio de estreptococos orais. A barra de escala representa 50 um.
Discussão
Anteriormente, muito trabalho tem incidido sobre a alteração do TiO 2 superfícies para melhorar osseo-integração e estudos investigaram tanto a adesão de osteoblastos in vitro
[13, 14] e tecido integração in vivo
[25]. No entanto, ainda existem lacunas significativas no nosso conhecimento sobre a aderência ea função das células dos tecidos moles na interface pilar-mucosa. Neste estudo, a adesão de queratinócitos e fibroblastos para duas superfícies; um formado por oxidação anódica em CpTi (N1) e a outra, formado por oxidação anódica de uma liga de titânio (N2), foi comparada com a de uma superfície de controlo de CpTi. Ambas as superfícies foram modificados nano-estruturado com poros nas 50 Nm cobrindo toda a superfície. No entanto, eles diferiam em pore-densidade, com poros mais escassamente distribuídos e com áreas de livre de poros maiores no N2 do que na superfície da N1. Bem como modificações em nano-escala, a oxidação anódica pode causar alterações na superfície do material a granel, e o TiO 2 camadas superficiais da N1 e N2 foram demonstradas para conter níveis mais elevados de cristalina anatase do que o controlo de CpTi [21]. Embora os efeitos citotóxicos sobre as bactérias foram observadas na presença de radiação UV [26], pouco se sabe sobre os efeitos de anatase associado à superfície de células eucarióticas. No presente estudo, no entanto, os N1 e N2 superfícies ricas em anatase não demonstrou efeitos citotóxicos em ambos os fibroblastos ou queratinócitos.
O padrão de ligação de fibroblastos gengivais humanos foi um pouco diferente da dos queratinócitos. Ambos os fibroblastos e os queratinócitos foram capazes de ligar-se ao controlo de CpTi e as superfícies nanoestruturados. No entanto, enquanto o nível de adesão de fibroblastos para as superfícies de N2 foi semelhante à do Controlo CpTi, a aderência à superfície da N1 foi significativamente reduzida. Para queratinócitos, embora o número de células foi um pouco inferior na N2, não houve diferenças significativas na densidade celular global sobre as superfícies nanoestruturados, em comparação com que sobre o controle de CpTi. Os dados mostram assim que a presença e distribuição de poros não teve nenhuma influência sobre a adesão de queratinócitos orais ao passo que para os fibroblastos gengivais, uma poro alta-densidade reduzida aderência. Isto sugere que a ligação de fibroblastos gengivais foi afectada pela natureza do substrato ao passo que a de queratinócitos não foi influenciado, na mesma medida. Num estudo por Ma et ai
., A presença de nanotubules com um diâmetro de cerca de 100 nm reduzida adesão de fibroblastos em comparação com um controle de titânio polido [27] enquanto Guida et ai
. mostrou aumento da adesão de fibroblastos a superfícies nano-estruturados oxidados em comparação com controles de titânio transformaram [19]. Conclusões sobre os efeitos da nano-estruturas na função de fibroblastos são, portanto, difíceis de tirar da literatura atual. Para queratinócitos, os dados é limitado, mas Zile et al
. [18] mostraram que as superfícies de titânio nano-tubular promover a adesão em comparação com superfícies convencionais nano-suave. Neste estudo, o número de queratinócitos que adere à superfície de titânio convencional foi comparável ao observado para as superfícies de controlo do seu estudo, embora nenhum aumento na densidade das células nas superfícies nanoestruturados utilizados aqui foi observada. A formação de
uma vedação estanque entre o implante e os tecidos circundantes soft-deverá contribuir para a manutenção de tecidos saudáveis em redor de um implante [28, 29]. Estudos conduzidos em cães revelaram que o sol-gel derivados superfícies de titânio nanoporosas pode induzir o desenvolvimento de interacções hemidesmossoma entre a mucosa oral e a superfície do implante [16]. Da mesma forma, em seres humanos, o contacto entre os implantes de titânio e da mucosa bucal foi aumentada na presença de filmes de óxido de titânio sol-gel-derivados [17]. Portanto, a força adesiva dos queratinócitos e fibroblastos foi investigada usando um procedimento que removeram as células fracamente ligados. Um método semelhante foi utilizado anteriormente para investigar a adesão de células epiteliais e fibroblastos para titânio [23]. Os resultados deste estudo não revelou diferenças na força de adesão de queratinócitos ou f ibroblastos às superfícies anodicamente-oxidados, em comparação com o controlo de CpTi sugerindo que as nano-estruturas não influenciar a força de fixação de qualquer tipo de célula.
Isto está de acordo com os resultados de outro estudo in vitro
onde a força de adesão de fibroblastos não foi afetada pelas condições de superfície e materiais [30]. No entanto fibroblastos foram removidos para uma maior amplitude de todas as superfícies do que os queratinócitos, indicando uma força de aderência global inferior para estas células.
A maioria dos estudos in vitro
de a influência das propriedades da superfície do implante na adesão célula hospedeira ter sido realizada em ambientes livres de bactérias. No entanto, quando uma superfície de contacto é colocada na cavidade oral, a capacidade das células dos tecidos moles, especialmente os queratinócitos, para aderir pode ser influenciada pela presença de micro-organismos no ambiente bucal. portanto, foi investigado o efeito de um consórcio de streptococci de colonização precoce na aderência e força de adesão dos queratinócitos. adesão de queratinócitos foi largamente inibida quando as bactérias foram já presentes nas superfícies de titânio, sugerindo que a cura dos tecidos moles pode ser fortemente influenciada pela presença de biofilmes microbianos na superfície de encosto. Exposição de anexar queratinócitos às mesmas bactérias, redução da densidade de células de cerca de 50% e a integridade da membrana celular das células restantes parece estar comprometida. Enquanto o dano celular observada aqui foi de certa forma surpreendente já que estreptococos orais normalmente não são considerados como sendo patogénico, resultados semelhantes foram obtidos em estudos in vitro
onde osteoblastos foram expostos ao comensais da pele, Staphylococcus epidermidis
[31, 32] . Sabe-se que os estreptococos comensais produzir uma variedade de produtos finais metabólicos, incluindo lactato, acetato, etanol e formato, bem como enzimas (glicosidases e proteases) e antigénios bacterianos, incluindo o ácido lipoteicóico (LTA), que podem ser consideradas como possíveis mecanismos para a observada danos às células [33, 34]. Enquanto os queratinócitos podem responder a LTA através de receptores Toll-like [35], os efeitos de outras substâncias sobre a função dos queratinócitos são atualmente não é bem compreendida. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.
