biofilme microbiano da arte abstracta
Fundo
O tecido mole ao redor dos implantes dentários forma uma barreira entre o ambiente oral e osso peri-implantar e fundamental fator para o sucesso a longo prazo da terapia é o desenvolvimento de uma boa vedação pilar /-tecidos moles. Sol-gel nanoporoso derivado TiO
2 revestimentos têm sido mostrados para melhorar fixação de tecido mole, mas o seu efeito na adesão e formação de biofilmes por bactérias orais é desconhecido.
Métodos
foram investigadas como as propriedades de superfícies que pode ser usado em pilares: virou titânio, nanoporous sol-gel TiO 2 superfícies revestidas e anodizado Ca 2 + superfícies modificadas, afetar a formação de biofilme por dois colonizadores iniciais da cavidade oral: Streptococcus sanguinis
e Actinomyces
naeslundii. As bactérias foram detectadas usando 16S rRNA de fluorescência in situ
hibridação em conjunto com a microscopia confocal de varrimento laser.
Resultados
Interferometria e microscopia de força atômica revelou todas as superfícies a ser lisa (S a ≤ 0,22) . A incubação com um consórcio de S. sanguinis Comprar e A. naeslundii
não mostraram diferenças na adesão entre as superfícies mais de 2 horas. Após 14 horas, o nível de crescimento de biofilme foi baixa e mais uma vez, não há diferenças entre as superfícies foram vistos. A presença de saliva aumentou o biovolume biofilme de S. sanguinis Comprar e A. naeslundii
dez vezes em comparação com quando saliva estava ausente e isso foi devido ao aumento da adesão ao invés de crescimento do biofilme.
Conclusões
modificação nano-topográfica da superfície de titânio liso não teve nenhum efeito sobre a adesão ou a formação de biofilme precoce por S. sanguinis
e A. naeslundii
, em comparação com superfícies torneadas ou aqueles tratados com a oxidação anódica na presença de Ca 2+. A presença de saliva levou a uma significativamente maior biovolume biofilme mas não foram observadas diferenças significativas entre as superfícies de teste. Estes dados sugerem portanto que a modificação com sol-gel nanoporoso derivado TiO 2, o que foi mostrado para melhorar a integração óssea e a cura dos tecidos moles in vivo
, não causa uma maior formação de biofilme por as duas espécies comensais orais testadas de . das outras superfícies
material suplementar Electrónicas | a versão online deste artigo (doi:. 10 1186 /1472-6831-11-8) contém material suplementar, que está disponível para usuários autorizados
. Background
implantes dentários de titânio são usadas para substituir dentes perdidos e muito trabalho tem sido focado na otimização das propriedades mecânicas dos materiais de implante físico-químicas e de melhorar a sua integração com o osso hospedeiro e-tecidos moles. A barreira de tecido mole ao redor dos implantes dentários serve como um selo de proteção entre o ambiente oral e osso subjacente peri-implante e um fator proposta a ser de importância para o sucesso terapêutico a longo prazo da terapia com implantes é o desenvolvimento de uma boa pilar /soft selo -tissue [1]. Várias modificações de superfície de implantes, incluindo micro-topográficas e de superfície química alterações, foram investigados quanto aos seus efeitos sobre a cicatrização do tecido e, recentemente, o interesse voltou-se para as modificações no nível nanométrico de resolução [2]. Nanofeatured superfícies são consideradas como aqueles com estruturas mais pequenas do que 100 nm, em pelo menos uma dimensão, e nanofeatures foram caracterizados em pelo menos quatro implantes comercialmente disponíveis [3]. Sol-gel nanoporoso derivado TiO 2 revestimentos têm sido mostrados para melhorar fixação de tecidos moles em modelos de rato e de cão [4-6] e um estudo experimental em humanos indicaram que uma proporção significativamente maior de mucosa oral estava em contacto com um nanoporoso TiO 2 com uma superfície de superfícies não modificadas [7].
superfícies na cavidade oral são rapidamente cobertas com uma película de proteínas e glicoproteínas derivadas a partir da saliva e fluido crevicular gengival, assim como produtos microbianos secretados [8] . A composição, assim como a configuração e a densidade das proteínas na película, é largamente dependente da natureza física e química da superfície subjacente e, portanto, as propriedades da aderência bacteriana influência superfície embora a película. Numerosos microorganismos na fase planctônicas irá ser transportado para a superfície, mas são as propriedades da película de condicionamento juntamente com as propriedades de aderência de bactérias que determinam quais os organismos ligam e iniciar a formação de biofilme. formação de biofilme nas superfícies dos dentes é iniciada pela adesão dos colonizadores iniciais, tais como S. sanguinis Comprar e A. naeslundii
[9]. Os colonizadores iniciais promover a adesão de colonizadores secundárias por interacções co-agregação e microbianas que conduzem a maturação do biofilme [10]. A microbiota de implantes saudáveis se pensa ser semelhante ao observado nas superfícies dos dentes [11, 12], e Streptococcus spp
. e Actinomyces naeslundii
foram identificados como os primeiros colonizadores em uma variedade de superfícies de materiais de implante in vivo
[13]. Como é o caso da placa dentária, a capacidade de crescimento e metabolismo são os determinantes ecológicos de sobrevivência e persistência de bactérias orais sobre superfícies de implantes dentários. A multiplicação e metabolismo de microrganismos aderindo em última análise, resulta no desenvolvimento de uma comunidade microbiana estruturalmente organizada que está num estado de equilíbrio com o hospedeiro [14]. doença oral pode ocorrer sempre que os factores ambientais locais no biofilme conduzir a selecção e enriquecimento de agentes patogénicos putativos pertencentes à flora microbiana residente iniciando, assim, uma resposta inflamatória progressiva indução de reabsorção óssea em implantes dentários [15].
superfícies de encosto de titânio rugosa foram mostrados para aumentar a formação de placa bacteriana in vivo
[16]. No entanto, em comparação, as superfícies de encosto liso com valores de rugosidade superficial de & lt; 0,3 μ m, não promover a formação de biofilme in vivo
na mesma medida [17]. Liso, virou de titânio (TU), nanoporoso TiO 2 revestido (SG) e anodizado Ca 2+ modificado (OC) superfícies têm sido mostrados como sendo adequados para a integração óssea, bem como a cura dos tecidos moles [7, 18, 19]. Neste estudo, mostramos que não há diferenças significativas na formação de biofilme cedo por S. sanguinis Comprar e A. naeslundii
, sobre estas três superfícies lisas. No entanto, a presença de saliva levou ao desenvolvimento de um biofilme significativamente maior biovolume por estes dois colonizadores de todas as superfícies do que quando a saliva não estava presente.
Métodos Preparação de superfícies de titânio
discos de titânio comercialmente puro torneadas (grau 4), com um diâmetro de 8 mm e um furo central, foram divididos em quatro grupos. Os discos transformaram originais serviram como controlos (TU) e os outros grupos foram cada modificados em uma de três maneiras diferentes: tratamento de sol-gel para criar um nanoporoso TiO 2 revestimento (SG), de uma maneira semelhante ao tratado termicamente os discos tratados de sol-gel (HT), ou anodicamente oxidada e de cálcio tratado (OC)
Para o tratamento de sol-gel (SG), os discos foram limpos numa solução de base de peróxido de hidrogénio (H 2O;. 30 % H 2O 2, e 25% de NH 4Oh na proporção de 5: 1: 1) a 85 ° C durante cinco minutos. Após extensa lavagem em água destilada, os discos foram secos numa corrente de N 2. O sol foi preparado por mistura de solução 1 [10,22 g tetraisopropylorthotitanate, (Merck, Hohenbrunn, Alemanha) dissolvido em 15 ml de etanol] com uma solução de 2 [15 ml de etanol, 170 ul de H 2O e 840 ul de HNO 3 ]. Depois de se misturar durante uma hora, a 100 uL de PEG 400 (Merck, Hohenbrunn, Alemanha) foi adicionado e a solução agitada vigorosamente. O Sol clara foi mantida a temperatura ambiente durante o envelhecimento e o processo de revestimento por imersão. De revestimento por imersão foi realizada com o uso de uma fase do motor de passo, controlado por computador com uma velocidade de imersão de 30 mm /min, e os discos foram sinterizados num forno a 500 ° C (ar) durante 30 minutos. Depois de aquecer os discos foram limpos por ultra-sons em etanol durante quatro minutos e finalmente seco numa corrente de N 2. As superfícies tratadas com calor (HT), que serviu como controlos para as superfícies SG foram sinterizadas a 500 ° C (ar), como descrito acima. A oxidado anodicamente e (OC) superfícies de cálcio incorporada foram preparados por oxidação anódica com um eletrólito consistindo de hidrato de glicerofosfato de sódio (C 3H 6 (OH) 2 PO? 4Na 2 × H 2O) e acetato de cálcio (Ca (CH 3COO) 2) [20, 21].
Caracterização de superfícies de titânio
Para investigar rugosidade da superfície no nível micrômetro, três discos de cada superfície foram investigados em dez locais utilizando um interferómetro óptico (MicroXamTM, PhaseShift, Tucson, EUA). Cada medida foi realizada sobre uma área mm 200 × 260. Um filtro de Gauss passa-alto (50 × 50 mm) foi usada para rugosidade separada de erros de forma e ondulação [22]. A avaliação foi realizada com o software Surfascan e as imagens foram produzidas usando SPIP ™ (Scanning Probe Processador de Imagem, Metrologia, Dinamarca). Três parâmetros tridimensionais diferentes foram utilizados para caracterizar a superfície: média desvio altura [S a (im)], um parâmetro espacial - densidade de cimeiras [S ds (1 /mm 2)] e um parâmetro híbrido incluindo a variação de altura e direção espacial [S dr (%)].
A topografia de superfícies modelo de sílica, como para as superfícies revestidas SG-dip, foi caracterizada utilizando microscopia de força atômica (AFM 3100 , Nanoscope III, Instrumentos digital). Para caracterizar a topografia do nível nanômetros de resolução, o parâmetro de superfície bi-dimensional, média desvio altura [R a (nm)], foi aplicado. Espessura do revestimento foi medida com SG elipsometria nula no λ = 632 nm (Auto-El-III, Rudolph Research, EUA). O índice de refração assumido de TiO 2 em estrutura cristalina Anastase foi n = 2.49.
Cepas bacterianas e cultura
Para os ensaios de biofilme o tipo de estirpe orais Streptococcus sanguinis
ATCC 10556 e Actinomyces naeslundii
isolado a partir da placa dentária [23] foram usadas. Todas as estirpes foram rotineiramente mantidas em agar de sangue ou em caldo Todd-Hewitt (TH), a 37 ° C em 5% de CO 2.
Ensaio para a adesão e a formação de biofilme início
Imediatamente antes da inoculação bacteriana, discos foram limpos num banho de ultra-sons com Extran MA01 ® (Merck, Darmstadt, Alemanha) diluído 1:40 em água destilada, tratado com etanol, e colocado em poliestireno de 6 poços placas de titulação (de fundo plano) (Multiwell ™, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EUA). caldos de cultura durante a noite foram diluídos a 1:50 em fresco, pré-aquecido de caldo Todd Hewitt a 37 ° C em 5% de CO 2 e cultivados para a fase de crescimento meio-exponencial (DO 600 nm≈0.6). As culturas foram então diluídas para obter concentrações finais de cerca de 1 × 10 8 células /ml para S. sanguinis
e 1 × 10 7 células /ml de A. naeslundii
. 1,5 ml de S. sanguinis
e 4,5 ml de A. naeslundii
suspensões foram, em seguida, inoculadas em poços. A placa de microtitulação foi selado com fita de parafina e incubadas a 37 ° C num agitador rotativo a 300 rpm, em 5% de CO 2. Após incubação durante 2 h e 14, as superfícies foram lavadas três vezes com tampão de fosfato de potássio 10 mM, pH 7,5 (PBS) para remover as células fracamente ligadas. As bactérias aderentes foram fixadas em paraformaldeído a 4% para a hibridação de rRNA 16S. Todas as experiências de biofilme foram realizadas utilizando culturas bacterianas independentes três vezes para cada tipo de superfície.
Para as experiências de saliva, saliva completa não estimuladas foi recolhido a partir de um voluntário saudável com uma boa saúde oral, centrifugou-se durante 10 minutos para sedimentar as bactérias e as mucinas, e o filtro esterilizado-sobrenadante (tamanho de poro de 0,22 um). Alíquotas de suspensões bacterianas (1,5 ml de S. sanguinis
e 4,5 ml de A. naeslundii
) foram centrifugadas e o sedimento ressuspenso em 6 ml de saliva estéril. As suspensões bacterianas (contendo 10 7-colónia formadora de unidades por ml, tal como mostrado por cultura) foram então adicionados aos poços. As placas foram agitadas suavemente durante 14 horas a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2. Após este tempo, as superfícies foram enxaguados três vezes com 3 ml de PBS, fixadas com paraformaldeído a 4% e incubou-se durante a noite a 4 ° C.
16S rRNA FISH e microscopia confocal de varrimento laser
bactérias fixos sobre os discos foram lavados com frio , PBS estéril e sujeito a permeabilização da membrana celular com 100 ul de lisozima (Sigma, St Louis, MO, EUA) [(70 ul L -1) em 100 mM de Tris-HCl, pH 7,5 (Sigma, St Louis, MO , EUA) contendo EDTA 5 mM (Merck, Damstadt, Alemanha)] durante 9 minutos a 37 ° C. Após lavagem com água ultra-pura, as bactérias foram desidratadas através de uma série de lavagens com etanol. tampão de hibridação [0,9 M NaCl, tampão de Tris 20 mM-HCl, pH 7,5, com sulfato de 0,01% dodecilsulfato de sódio (SDS) e formamida a 25%], contendo 20 ng de sonda oligonucleotídica marcada ml -1 foi pipetada para os discos de titânio . O coquetel de sonda consistiu de sonda STR493 estreptocócica (5'-GTTAGCCGTCCCTTTCTGG-3 ') [24], marcado de forma fluorescente verde com ATTO-488 para avaliar a quantidade de S. sanguinis
, e uma sonda marcada com vermelho ATTO-565 EUB338 (5'-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3 ') [25] para avaliar o volume total de biofilme. A hibridação foi realizada a 47 ° C numa câmara húmida durante 90 minutos. As superfícies foram lavadas três vezes com Tris-HCl 20 (pH 7,5) contendo EDTA 5 mM e 0,01% de sulfato de dodecilo de sódio, e duas vezes com NaCl 159 mM, durante 30 e 15 minutos, a 47 ° C sob agitação suave. Finalmente, as superfícies de titânio foram lavadas com água ultra-pura gelada, montada e colada sobre lâminas de vidro para análise através de microscopia confocal de varrimento a laser invertido (CSLM) (Eclipse TE2000, Nikon, Tokyo, Japão). fluorescência verde foi fornecida por um laser de Ar (laser de excitação 488 nm) e fluorescência vermelha foi dada por um laser G-HeNe (543 nm de excitação laser). imagens CLSM foram adquiridos com o objetivo de imersão em óleo (× 60). Cada pilha tinha uma área de cobertura de substrato campo de 215 × 215 mm, e o z-passo foi de 2 ^ m. As imagens foram obtidas a partir de 15 locais selecionados aleatoriamente por disco. Análise de Imagem Editorial
As pilhas de imagens foram convertidas para o formato TIFF e analisados usando o software bioImage_L [26] para calcular os parâmetros estruturais do biofilme. S. sanguinis
ocupa tanto o EUB338 universal sonda (vermelho) (Figura 1a) e a sonda streptococcus específica STR493 (verde) (Figura 1b) e nas imagens apresentadas essas células parecem amarelo devido à co-localização das sondas (Figura 1C). A. naeslundii
, que ocupa apenas a sonda EUB338, aparece em vermelho (Figura 1c). Uma vez que o software utilizado não podia identificar células amarelo, o biovolume de S. sanguinis
foi quantificada utilizando-se o número de células verdes. O biovolume biofilme de A. naeslundii
foi então calculada indiretamente pela subtração do S. sanguinis biovolume
(verde) do biofilme do total. Figura 1 16S rRNA de fluorescência em imagens de hibridização in situ de S. sanguinis e A. naeslundii em biofilmes mono e dual-espécies. imagens CSLM mostrando biofilmes dual-espécies de S. sanguinis Comprar e A. naeslundii
(a) coradas com o EUB338 16S rRNA sonda FISH vermelho, (b) manchado com a sonda FISH STR493 16S rRNA verde ou (c) coradas com ambas as sondas. O bar apresenta 4 mm
análise estatística
o teste não paramétrico de Mann-Whitney foi utilizado para analisar diferenças de biovolume biofilme entre as superfícies de teste e controle e valores de p & lt.; 0,05 foram considerados significativos.
Resultados e Discussão
Caracterização das superfícies de titânio
Caracterização da orientação da superfície por interferometria revelou que o nanoporoso (SG) de superfície, bem como o tratado termicamente (HT) e anódico oxidado Ca 2+ incorporados (OC) superfícies foram isotrópico enquanto que a superfície virada (TU) era anisotrópica (com a topografia da superfície orientada) (Figura 2, a coluna da esquerda). As medições de parâmetros de superfície (Figura 2, coluna da direita), revelou que a superfície nanoporoso (SG) teve um desvio médio da altura da superfície (S a) de 0,16 ± 0,04 uM enquanto que a área de superfície desenvolvida [27] e a densidade cúpula ( S ds) foram de 3 ± 1% e 0,13 ± 0,005 cimeiras /mm 2, respectivamente. Esta topografia foi semelhante ao do controlo tratado com calor (HT) (S a 0,16 ± 0,02 ^ M, S dr 3 ± 1%, S ds 0,12 ± 0,007 cimeiras /iM 2) ea virada (TU) (S a 0,18 ± 0,02 mm, S dr 4 ± 1%, S ds 0,13 ± 0,022 cimeiras /mm 2) superfícies. O anódico oxidado Ca superfície 2 + incorporado (OC), no entanto, apresentaram valores mais elevados para o desvio altura média (0,22 ± 0,01 mm), razão de área de superfície desenvolvida (15 ± 2%), e densidade cúpula (0,23 ± 0,003 cimeiras /mm 2). Assim, a superfície do OC teve um pouco maiores estruturas microtopographical do que as outras superfícies investigado e tinham uma maior área de superfície potencial de interações bacterianas. No entanto, apesar das diferenças no nível de microescala da rugosidade entre a TU, SG e HT, de um lado e a superfície do OC no outro, todos foram classificados como bom (ou seja
S a. & Lt; 0,5 μ m) [28]. Figura 2 imagens Interferometria de superfície e de características das superfícies de titânio lisas. Imagens de interferometria foram produzidos com SPIP ™. O desvio médio altura (Sa), a densidade de cimeiras (SDS) e alargamento de superfície (SDR) são apresentados para as diferentes superfícies; SG (sol-gel derivado TiO2 nanoporous revestido), HT (tratado termicamente), TU (virou) e OC (oxidado anodicamente Ca2 + incorporada) superfícies.
Imagem em superfície microscopia de força atômica de sol-gel nanoporous derivado TiO 2 superfícies mostraram que as partículas eram bem distribuído e organizada (Figura 3). O revestimento levou à formação de nanoestruturas de alguns nanómetros até 100 nm, com R a 1,58 nm. A espessura do TiO nanoporoso 2 de revestimento, foi de 90 nm ± 10 nm, como medido por elipsometria. Figura 3 Caracterização da superfície revestida do nanoporous TiO 2 usando microscopia de força atômica. Uma imagem representativa AFM da superfície de TiO2 revestido nanoporoso. Observe o nanofeatures homogêneos e uniformemente distribuídos.
Propriedades de superfícies lisas não influenciam a adesão e formação de biofilme cedo por S. sanguinis e A. naeslundii
O principal objetivo do presente estudo foi investigar a adesão microbiana a nanoporous TiO < sub> 2 (SG) superfícies e comparar a outras superfícies de titânio suaves usados para pilares de implantes. O modelo utilizado é compatível com CLSM uma vez que os discos podem ser montados sobre lâminas de vidro-e visualizados directamente no microscópio. A quantidade de bactérias sobre as superfícies após 2 horas de incubação foi considerada para representar o grau de adesão bacteriana à superfície. Após 2 horas, A. naeslundii
e S. sanguinis
estavam presentes em todas as superfícies como aglomerados de células esparsamente distribuídos (Figura 3b - painel superior). O biovolume biofilme sobre a superfície de SG foi semelhante ao do controlo HT e a superfície de TU. A superfície OC No entanto, mostrou um nível ligeiramente mais elevado de aderência, mas esta não era significativamente diferente do-as das outras superfícies (p = 0,05) (Figura 4A). Assim, parece que o nível mais alto de rugosidade microescala visto que a superfície de CO não foi suficiente para proteger as bactérias de forças de afastamento. Resultados semelhantes foram obtidos em um estudo in vivo
em que as superfícies com um S a = 0,21 pM mostrou um pouco maiores níveis de microrganismos aderindo do que aqueles com um S uma na gama de 0,05-0,13? M [29] e uma rugosidade média de altura (P a) de 0,2 um tem sido proposto como um limite para a adesão bacteriana significativa [17]. A proporção de A. naeslundii
foi maior do que a de S. sanguinis
em todas as superfícies (aproximadamente 85% do biofilme biovolume), sugerindo que, sob estas condições, A. naeslundii
era mais capaz de aderir de S. sanguinis
. Figura 4 A formação de biofilme por S. sanguinis e A. naeslundii mais de 2 e 14 horas nas superfícies de titânio lisas. (A) Gráficos mostrando a média ± SD de volume de biofilme gerada a partir de três conjuntos independentes de experiências. SG (sol-gel derivado TiO2 nanoporous revestido), HT (tratamento térmico), TU (virou) e OC (oxidado anodicamente e Ca2 + incorporada). Não foram observadas diferenças significativas entre as superfícies em cada ponto de tempo. (B) Imagens representativas de CSLM de 2 e 14 horas biofilmes visualizados com 16S rRNA FISH usando sondas de oligonucleotídeos segmentação S. sanguinis
(STR493 - verde) e todas as bactérias (EUB338 - vermelho). Uma vez que tanto o EUB338 vermelho e a sonda STR493 verde foram retomadas por S. sanguinis
, as células aparecem amarelo, enquanto que A. naeslundii
que incorpora somente a sonda EUB338 aparece vermelho. As barras de escala representam 10 um.
Após 14 horas, na presença de meio de crescimento TH, as bactérias aderidas começaram a crescer e dividir-se e os níveis de cobertura microbiana são, assim, considerados como reflectindo as fases iniciais da formação de biofilme. No entanto, os níveis de crescimento visto aqui entre duas e 14 horas eram baixos, o que pode reflectir o facto de que, em contacto com uma superfície, de bactérias planctónicas sofrer uma transição de crescimento exponencial a uma taxa de crescimento muito mais lento [30]. Não há diferenças nos níveis de cobertura entre as diferentes superfícies pode ser observado (Figura 4b, painel inferior). De acordo com estas observações, não houve diferenças na biovolume total de biofilme entre as quatro superfícies foram detectados. A proporção relativa de S. sanguinis
tinha aumentado para 31%, embora os níveis ainda inferiores aos de A. naeslundii
(69%). Assim, embora os níveis iniciais de adesão eram ligeiramente mais elevada na superfície do CO, possivelmente devido à maior área de superfície, o que não foi sustentada como o biofilme começou a desenvolver-se.
A saliva aumenta a adesão de S. sanguinis e A. naeslundii em biofilmes dual-espécies
para investigar se a saliva afetados superfície de adesão, S. sanguinis Comprar e A. naeslundii
foram suspensas em saliva estéril antes da exposição às superfícies. Isto aumentou a aderência de ambas as espécies em todas as superfícies depois de 2 horas (Figura 5B, painel superior). As bactérias estavam presentes como agregados, provavelmente devido a agregação de células cobertas com proteínas salivares. O aumento era de até 11 vezes (Figura 5a), em comparação com na ausência de saliva (Figura 4A), sugerindo que a saliva promoveu a aderência destas duas espécies. Em contraste, nos estudos anteriores foi mostrado pré-revestimento de superfícies de titânio com películas salivares experimentais para não afectar a aderência de A. naeslundii
[31]. Esta diferença pode ser atribuído ao facto de que, no estudo de Lima et al
. 2008, as bactérias foram suspensas em caldo de nutrientes, em vez de saliva. Figura 5 formação de biofilme por S. sanguinis e A. naeslundii, na presença de saliva ao longo de 2 e 14 horas nas superfícies lisas de titânio. (A) Gráficos mostrando a média ± SD de volume de biofilme gerada a partir de três conjuntos independentes de experiências. SG (sol-gel derivado TiO2 nanoporous revestido), HT (tratamento térmico), TU (virou) e OC (oxidado anodicamente e Ca2 + incorporada). Não foram observadas diferenças significativas entre as superfícies em cada ponto de tempo. (B) Imagens representativas de CSLM de duas e 14 horas biofilmes visualizados com 16S rRNA FISH usando sondas de oligonucleotídeos segmentação Streptococcus sanguinis
(STR493 - verde) e todas as bactérias (EUB338 - vermelho). Uma vez que tanto o EUB338 vermelho e a sonda STR493 verde foram retomadas por S. sanguinis
, as células aparecem amarelo, enquanto que A. naeslundii
que incorpora somente a sonda EUB338 aparece vermelho. As barras de escala representam 25 um.
Após 14 horas sem grande mudança foi visto no biovolume biofilme indicando que nenhum crescimento havia ocorrido na presença de saliva. No entanto, estes dados são susceptíveis de subestimar a formação de biofilme e do crescimento in vivo, uma vez que
em biofilmes em implantes dentários superfícies recrutamento de uma variedade de outras espécies bacterianas permitiria uma acção concertada para degradar as glicoproteínas salivares e, assim, proporcionar nutrientes para o crescimento [32] . As diferentes superfícies não mostraram diferenças em biovolume total de biofilme (p & lt; 0,05). E a proporção das espécies bacterianas foi semelhante em ambos os 2 e 14 horas, com A. naeslundii
constituindo cerca de 80% do biovolume
o modelo utilizado aqui habilitado as diferentes superfícies a ser testado na presença de saliva. O uso de ARNr 16S de peixe permite a detecção de variações entre espécies na adesão e crescimento, bem como as relações espaciais entre as bactérias em várias superfícies. Além disso, a lavagem extensiva durante o procedimento FISH 16S rRNA assegura que as bactérias só é verdadeiramente aderidas estão presentes na superfície durante a quantificação. Uma desvantagem do modelo é que a agitação suave usada aqui pode não reflecte com exactidão as forças de corte presentes numa superfície exposta na cavidade oral. No entanto, isso pode ser superado através da utilização de um modelo de fluxo de câmara-[33].
Conclusões
modificação Nano-topográfica da superfície de titânio liso não causou significativamente maior adesão e formação de biofilmes por S. sanguinis
e A. naeslundii in vitro
do que foi encontrado em superfícies torneadas ou aqueles tratados com Ca 2 + incorporação durante a oxidação anódica. Na presença de saliva, a adesão foi aumentada mais de dez vezes em comparação com na ausência de saliva e não foram observadas diferenças entre as superfícies. Estes dados sugerem que a modificação com derivados de sol-gel nanoporoso TiO 2, o que foi mostrado para melhorar a cicatrização de tecidos moles in vivo
, não leva a uma maior adesão e formação de biofilmes inicial pelas duas espécies testadas de comensais as outras superfícies. No entanto, não se pode excluir que, ao longo de um período de tempo mais longo na presença de outras espécies bacterianas, maiores diferenças na formação de biofilmes sobre as diferentes superfícies pode ser visto: Lista de abreviaturas
CLSM:.
confocal de varredura a laser micrscopy
PBS:
tampão fosfato de potássio 10 mM, pH 7,5
FISH:
de fluorescência in situ
hibridação
TU:
virou superfícies
OC: Ca 2 + incorporada superfícies
oxidado anodicamente
SG:
sol-gel nanoporous derivado TiO 2 superfícies revestidas
HT: superfícies tratados termicamente
.
Declarações
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado pelo Swedish Dental Society, a Fundação Hjalmar Svensson Research, o Conselho de Pesquisa sueco (AW), e da Fundação Conhecimento, Suécia.
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os autores declaram que não têm interesses conflitantes. contribuições
dos autores
VF participaram no planejamento do estudo, realizado a maior parte do trabalho de laboratório, e participou na análise de dados e elaboração do manuscrito. PL preparadas as superfícies de sol-gel derivados e participou na elaboração do manuscrito. AW participou do planejamento do estudo ea elaboração do manuscrito. LCP participou no desenho experimental e elaboração do manuscrito. GS participou no desenho do estudo, análise de dados e elaboração do manuscrito. JRD participou na análise de dados e elaboração do manuscrito. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.
