citocromo oxidase e NADH redutase citocromo c foram analisadas bioquimicamente em hiops gingiv.il & gt; espécimes obtidos de 22 pacientes do sexo masculino (idade 23-72) submetidos a tratamento periodontal. Histologicamente. 13 casos apresentaram inflamação leve, enquanto 9 apresentaram respostas inflamatórias mais graves. actividade de oxidase do citocromo foi significativamente maior no ligeiramente inflamada do que em amostras de tecidos acentuadamente inflamadas. NADH citocromo c redutase, por outro lado não foi significativamente alterada pelo aumento do grau de inflamação. A possível implicação do efeito da inflamação sobre enzimas oxidativas é discutido em relação à degenerativas e alterações proliferativas que ocorrem em ambos os tipos de tecido.
Introdução
O citocromo-oxidase (E.C1.9.3.1 .) e NADH citocromo C reductase (ECI, 6. 2. I.) foram determinados em gengiva humana essencialmente normal (Eichel & amp; Sharhrik 1964), no entanto estes parâmetros não foram previamente analisadas em relação aos efeitos impostas pela inflamação gengival. estudos respiração endógena revelou que o QOj é estimulada na inflamação gengival leve, e deprimido na gengiva altamente inflamadas (Glickman el al 1949, Manhold & amp;. Volpe 196,1). Em estudos recentes polarographie outro lado (Zajieck & amp; Kindlova 1972) revelou que QO_ inicial. valores permaneceram constantes na gengiva humana e não foram significativamente alteradas por o grau de inflamação. À luz destes pontos de vista divergentes, queremos apresentar um relatório sobre o efeito da inflamação sobre as atividades redutase citocromo-oxidase e NADH citocromo c em homogeneizados totais de gengiva humana.
Métodos e Materiais
Preparação do tecido
biópsias gengivais humanos foram obtidos irom 22 pacientes do sexo masculino (23-72 anos), submetidos a tratamento periodontal. anestesia de bloqueio regional foi utilizada para evitar a infiltração do tecido. O tecido foi cirurgicamente removido e cortado em duas porções uma das quais foi preparada para estudo histológico. A outra foi lavada em tampão de fosfato frio 0,075 M, pH 7,0. para remover o sangue aderente e rapidamente congeladas a - 70 ° C e; C em gelo seco. O fro /en amostras gengivais foram analisados para a sua actividade enzimática dentro de um dia após a sua remoção. homogenatos gengivais foram preparados através de uma modificação dos métodos (Hoober & amp; Bernstein 1966) utilizados tor a homogeneização da pele do rato. O tecido gengival congelada (25 -5U mg em peso húmido.) Foi imersa em N líquido, (-270'C) durante 3 minutos, e pulverizada para pequenos fragmentos granulares. Os fragmentos gengivais foram homogeneizadas em tampão frio de Ten Broeck homogeneizadores em vidro fosco que foram moídas para se encaixar com uma tolerância de apuramento o ((1,1-0,15 mm. As atividades enzimáticas foram determinadas imediatamente após a homogeneização do tecido.
Análise enzima
o citocromo-oxidase (CE 1. 9. 3. 1.) (Wainio et al 1951). foi determinado por espectrofotometria hy após a oxidação de ditionito reduzida citocromo c * na I al 25 & deg; C num Gilford Modelo 2400 espectrofotómetro. em experiências nil a taxa de auto-oxidação de lerrocytoehrome C antes da adição da enzima foi negligenciável. a E.VHI "", os valores de absorvância para a resolução de homogeneizado foram na sua maior parte insignificante (0,0% em 16 amostras), e no caso de detecção que variou de 0, (12-13,0 ';. o de valor enzimática o valor médio de sedimentação foi de 2,5 & plusmn;. 0,9 Ci de 22 amostras que foram analisadas Resolução de valores foram determinados por re-reduzindo a reacção mídia com excesso de ditionito, ressuspensão do homogeneizado na mídia reação, e na sequência da alteração da absorvância óptica a tempo Ejaonni vs- graficamente. Os valores de sedimentação foram subtraídos ao valor de absorção total observada obtidas nos ensaios de enzima afectadas, e as actividades específicas foram determinadas a partir dos valores corrigidos. A mistura de reacção continha: 75 mM de KH..PO | -Na, .HPO4 tampão de pH 6,75. 5,6 uM de citocromo c e (25-150) da proteína gabarito (homogenale) num volume final de 300 u. concentração de citocromo c foi determinado a partir do coeficiente de extinção milimolar do citocromo c H - ,, -,;, t] odos = 18,5 mm 'cm' para o cvtoehrome reduzida de menos oxidado c
NADH citocromo c redutase.. NADH citocromo c redutase (E.C. 1. 6. 2. 1.) (Jeng et al. 1968) foi determinada seguindo a redução do citocromo c em Er ,, Tnm a 25'C. O coeficiente de extinção milimolar utilizada para citocromo C no ensaio de citocromo-oxidase foi utilizado para este ensaio. O sistema de ensaio continha: 33 mM de KHiPOi-NaoHPO, pH 7,75, S.2 FTM citocromo c, 3,0 mM de KCN, 85 /** LIM NADH e (25-150) ^ g de proteína (homogeneizado) no volume final de.. 300 II.
atividades específicas
As actividades específicas são expressos como nanomoies de citocromo c oxidada (citocromo oxidase) ou reduzida (NADH citocromo c redutase) por mg de proteína por min.
proteína Determinação
homogenatos de tecido (10-20 /a) foram digeridos em NaOH 0,05 N (concentração final) durante uma hora a 25 ° C e; C, e analisado para a proteína pelo método de Lowry et ai .. ( 1951). albumina cristalina *** foi usado como um padrão.
Estatísticas
A média, desvio padrão e erro padrão foram determinados para cada grupo. Valores superiores aos limites & plusmn; 1,96 DP foram descartados. A diferença entre cada grupo foi analisada pelo teste de "t de Student" e todos os valores de p. pulverização da (questão, descongelação e homogeneização subsequente parece perturbar de forma adequada as células. A evidência para esta interpretação reside na observação de que a distribuição de NADH citocromo c redutase em ambos gengiva ligeiramente inflamada e marcadamente inflamado não variaram significativamente. Se o declínio na citocromo-oxidase foi influenciado por nossas técnicas de preparação de tecidos, resultados semelhantes devem ser observadas nas distribuições c reductase NADH citocromo. a quantidade de fixando-se em nosso sistema de ensaio foi encontrado para ser insignificante para a maior parte e não poderia explicar o declínio acentuado na atividade de citocromo-oxidase observada na gengiva inflamada acentuadamente.
A atividade cylochiomc oxidase elevada observada em nosso estudo coincide com as observações feitas por Manhold e Volpj (1963) em seus estudos QCK respiração endógena de gengiva humana levemente inflamado e proliferando. o aumento da qualidade de vida & gt; e citocromo-oxidase na gengiva podem representar um aumento da síntese mitocondrial ligação de alta energia (ATP), que é necessária para sustentar os processos altamente synthelic associados com a síntese de ADN, mitose, assim como proliferação celular. Outra evidência para o aumento dos requisitos bioencrgelic no pré-proliferação e estágios de proliferação de desenvolvimento de células é a observação de que o aumento da qualidade de vida. (Respiração endógena) (Glickman el al. 1949), e citocromo-oxidase (Belas 197 (1) atinge picos de actividade, numa altura em grandes aumentos no índice mitolic e proliferação (epitheiialization) ocorrem na regeneração gengivais e feridas na pele. No por outro lado IHE declínio acentuado na citocromo-oxidase e Qoo endógena observado em marcadamente inflamado (Manhold & amp;. Volpe 1963, Giickman et al 1949) gtngiva parecem ser reflexos de mudanças que ocorrem dentro das mitocôndrias, bem como outros componentes subcelulares durante a destruição do tecido gengival significativa . Não foi possível delect um aumento da citocromo-oxidase em gengiva marcadamente inflamado e proliferar. embora os aumentos na QO endógeno. foi detectado por Giickman et al. (1949), neste tipo de patologia gengival. no entanto, é lhal concebível como inflamação diminui, uma fase de pré- proliferativa (fase S da mitose) ocorre dentro das células que migram na borda da ferida, que requer o aumento da síntese de ATP. Subsequentemente, um aumento de qualidade de vida endógena. é também observada. Nossos dados citocromo-oxidase, e os dados relatados para a respiração endógena QOj não coincidem com a QO polarographic. observações feitas por Zajieek e Kindlova (1972), que relataram thai do QO_ inicial & gt; valores permaneceram constantes na gengiva humana, e não foram significativamente alteradas por o grau de inflamação.
NADH citocromo c redutase actividade não foi significativamente alterada pelo grau de inflamação na gengiva humana. Nossos dados para gengiva humana paralela a observação feita por Eichel e Shahrik (1964), para a gengiva não inflamada humano. NADH cylochrome c redutase atividade foi encontrado para ser significativamente maior do que cytohrome oxidase em nossos estudos que se correlaciona com a observação feita por Eiehcl e Shahrik